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(無題) 削除/引用 No.8266-17 - 2019/09/27 (金) 10:16:39 - mon 異種タンパク(cDNA)を大腸菌で発現させる場合、mRNAの高次構造（パリンドローム?)により予期せぬ転写終結（＝完全長タンパクが翻訳されない、分解も速い？）も起こりえるようです。 コドン最適化はこのような懸念も考慮して行われるとメーカーは謳っています。

(無題) 削除/引用 No.8266-16 - 2019/09/26 (木) 00:42:35 - おお >C末端側にするとかはいかがでしょうか？ あなたのデザインなど存じ上げてないので（見落としてたらごめん）、どれがいいとか言いにくいですが、、、S-Sが気になるような蛋白であればPeriplasmic spaceに分泌させてみたらどうでしょうか。 あるいはPichia Pastorisというイーストを使った分泌型蛋白発現は優れているという話をよく聞きます。商品化されていますので調べてみてはどうでしょうか。基本的にはそのベクターに組み込みTransformationしてクローンを拾い、増殖させて誘導するだけの話ですので。

(無題) 削除/引用 No.8266-15 - 2019/09/24 (火) 21:37:54 - Eragon >[Re:14] おおさんは書きました : > >おおさん > >発現はWBで、サンプルは大腸菌のペレットを2xSample bufferで溶かしたものです。 > > これで何も引っかからないようならコンストラクションの問題の可能性も考えてもいいのかもしれません。 C末端側にするとかはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8266-14 - 2019/09/24 (火) 21:36:35 - おお >おおさん >発現はWBで、サンプルは大腸菌のペレットを2xSample bufferで溶かしたものです。 これで何も引っかからないようならコンストラクションの問題の可能性も考えてもいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8266-13 - 2019/09/24 (火) 19:46:11 - Eragon >[Re:12] totoさんは書きました : > > シャペロンとの共発現は可溶化の促進、発現上昇という印象ですが、発現していないものが発現するようになったという経験はありますでしょうか？ > > 何種類かのシャペロンの共発現でもやってみましたが、使ってよかったという経験は一度もありませんでした。発現しないものというのは、他の原因も考慮した方が良いです。うまく行くのもあるのでしょうが、他の方が書かれたように、この辺でダメなら、真核細胞の発現系に行った方が結果的に早いです。単純なHEK293での発現でも意外と取れるし。真核細胞の発現系は量がネックになることが多いですが、少なくとも質という点では、大分いい印象があります。 > そうですね。ただ、今の最大の問題は量なんですよね。 先にHEKとかでも試したのですが、pull downのbeitや抗原にするほど量が取れず、量が簡単に増やせる大腸菌でやっています。 インビトロジェンのBL21 Star（DE3）を試したことがある方、いらっしゃいますか？

(無題) 削除/引用 No.8266-12 - 2019/09/24 (火) 17:01:23 - toto > シャペロンとの共発現は可溶化の促進、発現上昇という印象ですが、発現していないものが発現するようになったという経験はありますでしょうか？ 何種類かのシャペロンの共発現でもやってみましたが、使ってよかったという経験は一度もありませんでした。発現しないものというのは、他の原因も考慮した方が良いです。うまく行くのもあるのでしょうが、他の方が書かれたように、この辺でダメなら、真核細胞の発現系に行った方が結果的に早いです。単純なHEK293での発現でも意外と取れるし。真核細胞の発現系は量がネックになることが多いですが、少なくとも質という点では、大分いい印象があります。

(無題) 削除/引用 No.8266-11 - 2019/09/24 (火) 16:49:17 - Eragon >[Re:9] monさんは書きました : > >[Re:5] totoさんは書きました : > > Rosseta-gami Bを使われたということは、S-Sを持ってる蛋白なのですね。 > となると、Rosseta-gami BからpRARE plasmidを取り出して、SHuffle株に目的タンパク発現ベクターと一緒にいれてみるのはいかがでしょうか。 > www.nebj.jp/f/754 > > そうですね。Shuffleも考えましたが、Rosseta-gamiとの違いはDsbCというシャペロンの働き見たいですね。 シャペロンとの共発現は可溶化の促進、発現上昇という印象ですが、発現していないものが発現するようになったという経験はありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8266-10 - 2019/09/24 (火) 16:44:24 - Eragon おおさん 発現はWBで、サンプルは大腸菌のペレットを2xSample bufferで溶かしたものです。

(無題) 削除/引用 No.8266-9 - 2019/09/24 (火) 16:16:56 - mon >[Re:5] totoさんは書きました : > Rosseta-gami Bを使われたということは、S-Sを持ってる蛋白なのですね。 となると、Rosseta-gami BからpRARE plasmidを取り出して、SHuffle株に目的タンパク発現ベクターと一緒にいれてみるのはいかがでしょうか。 www.nebj.jp/f/754

(無題) 削除/引用 No.8266-8 - 2019/09/24 (火) 12:47:41 - asan もともと真核生物のタンパク質を大腸菌に作らせることに無理がありますからね。発現しない、というのが全く翻訳されない、というのならコドンオプティマイズとかRosettaなどで効果的かもしれませんが、単に封入体にがっつで可溶化が困難というなら難しいケースが多いです。温度やIPTGの誘導条件をかえたり、pColdなどのベクターを利用して低温でインダクションするなどの手法は取られますが、決定的なことはあまりない場合も多いです。 最近はバキュロと昆虫細胞利用してたんぱくととるとかの方が現実的なので、時間と手間は少しかかりますが、頻繁にin vitro合成するなら検討してもいいと思います。 あとは、お金があるなら蚕とかつかった奴を外注するかですね。

(無題) 削除/引用 No.8266-7 - 2019/09/24 (火) 00:50:44 - おお あ、あと発現の検出はどのように行ってますか？WBで検出できるなら発現してないとは言えないし、Construction的には致命的なミスはないと言えます。必要量によってはそのままの系で精製していくてはあります。 また発現の確認はTotal lysatesでしょうかそれとも抽出したあとの可溶化されたものを使ってますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8266-6 - 2019/09/24 (火) 00:46:23 - おお Cell-free protein expression は最近はあまり使われないんでしょうか。各社出しているようですが。昔はロッシュだったと思いますが膜を使ったやつと、確か東洋紡かどっかと思うんだけど、９６Wellプレートでグリセロールをつかって２層にするやつをなんとなく覚えています。 細胞に対する毒性はほぼ関係がないのでその分効率が良くなるのではないかと。 レアコドンのtRNAを発現させた大腸菌もあるようですが。 発現しない理由はどんな大腸菌を使っても発現が望めないようなConstructionのデザインのためということはないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8266-5 - 2019/09/23 (月) 22:33:12 - toto Rosseta-gami Bを使われたということは、S-Sを持ってる蛋白なのですね。発現しない、ということであれば、酸化的フォールディングが原因ではという気がします。なかなか難しいですが、pColdにしたらうまくいったときや、培地にArg(0.2M)を入れたら有効だったときもありました。それでだめなときはタグの位置を変えてます。コドンは今ではほぼIDTのcodon optimization toolで設計してます。codon usageをみながらいじれるので楽です。

(無題) 削除/引用 No.8266-4 - 2019/09/23 (月) 18:57:42 - mon genscript、invitrogenを利用したことがあります。二次構造予測なども行っていることや、実績が多いので安心感があります。 他社webで設計して、より安価な海外メーカーで合成したこともあります。

(無題) 削除/引用 No.8266-3 - 2019/09/23 (月) 17:53:05 - Eragon >monさん ありがとうございます。Codonの最適化、おすすめのメーカーはありますか？

(無題) 削除/引用 No.8266-2 - 2019/09/23 (月) 17:46:55 - mon 費用は掛かりますが、コドン最適化した合成遺伝子をお薦めします。

Rosseta-gami Bで発現しないタンパク質を発現させる 削除/引用 No.8266-1 - 2019/09/23 (月) 17:40:36 - Eragon 大腸菌での組み換えタンパク質を作製したことがある方に質問です。Rosseta-gami Bで発現しなかったタンパクをどうにか発現させる方法はありますか？ ベクターのCodon usageを見ましたが、RARE codonの補充はしたほうがいいと考えています。 ただ、組み換えタンパク質を発現させる中でも最高峰レベル？のRosseta gami Bで発現しない場合のリカバリー方法は何かありませんか？

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