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(無題) 削除/引用 No.8265-6 - 2019/09/23 (月) 20:15:32 - Eragon そうですよね。 IPもやってみましたが、発現量があまり高くなく、銀染色でもbeit以外のタンパク質が見えず、バックも高いので、あきらめました。

(無題) 削除/引用 No.8265-5 - 2019/09/23 (月) 18:19:07 - asan HIs tagで可溶化できるならHis tagで問題ないと思います。 ただ、imidazolの持ち込みがその後の実験に影響を与える可能性があると、透析する必要があったりするのと、もともとGSTは非常に水溶性の高いタグなのでそれ自体で可溶化しやすいから使われているというだけだと思います。 もっとも最近は、MSの感度があがってきてるのであまりin vitroでpull downをやらないと行けないことも少なくなって来てるので生理的な結合を見る目的だったら直接細胞内でやってしまう場合が多いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.8265-4 - 2019/09/23 (月) 17:54:31 - Eragon なるほど たしかにHis抗体を使うと... ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8265-2 - 2019/09/23 (月) 17:44:02 - mon GSTが主流なのは、歴史が古く可溶性タンパクとして発現させた応用例が多いからでしょう。精製も容易ですし。 Hisタグは、非特異的結合がそれなりにあること、アミノ酸などの不純物やイオン性界面活性剤によってNTAとの結合が阻害されることなどから、Pull-Downアッセイに使いづらいからだと思います。 抗Hisタグ抗体によるPull-Downアッセイは上手くいくのかな？

Pull down assay 削除/引用 No.8265-1 - 2019/09/23 (月) 17:24:40 - Eragon pull down assayの経験者、タンパク質相互作用解析に詳しい方 素朴な疑問なのですが、なぜ、pull down assayを行う際、GSTが主流なのでしょうか。 ヒスチジンタグのほうが小さいので、大腸菌で発現しないといった問題を回避しやすいと思ったのですが。 現在、ヒスチジンタグではBaitが大腸菌でうまく発現するのですが、GSTタグにするとwestern levelでも全く発現せず、今後の結果次第ではGST-pull assayではなく、His-pull down assayに切り替えようと考えています。 ただ、Ni-agaroseは理由はよくわかりませんが、海面活性剤の種類が限られてくるといった記述を見つけたのが気になるので、この辺のほうも知っている方教えてください。

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