BioTechnicalフォーラム [サーマルサイクラーの一時停止後の放置温度について]

サーマルサイクラーの一時停止後の放置温度について

No.8257-TOPIC - 2019/09/19 (木) 01:11:58 - popo

RT-PCRの過程でRNAサンプルを70℃（ホットスタート）で10分インキュベートする場面があります。
サーマルサイクラーを事前に温めておき、RNAサンプルをサーマルサイクラーに入れた後、再開を押すのを忘れたまま10分経過させてしまいました。
この間、画面で表示されていた温度は69℃でしたが、この場合ずっと69℃のままインキュベートしたものとみなして良いのでしょうか？それとももう一度70℃で10分インキュベートすべきでしょうか？

確認を怠った私のミスなのですが、経験のあるかた教えて頂けると幸いです。
　

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No.8257-5 - 2019/09/24 (火) 23:08:54 - popo

返信が遅れてしまいましたがお二方、素早いご回答ありがとうございました。大変勉強になりました。

おおさん

そうです。情報不足ですみません。pauseを押した後解除を押すのを忘れました。すぐ結果を出さなければいけずはじめからやり直すか迷っていましたが、回答を見て、あの後問題なくRTしてPCRに持ち込むことができました。返信が遅れてしまいましたが、素早い回答ありがとうございました。70℃で10分は教授に教わったのですが、長いのですね。勉強になりました。

もさん
機種によって定義は異なるのですね。初めて知り勉強になりました。今後は機種を忘れずに書くようにします。ちなみにサーマルサイクラーはTaKaRaを使用しており、試薬はTaKaRaのRandom Primer 9merを用いておりました。熱変性は70℃ですと2分で十分なのですね。無知でお恥ずかしい限りです。教えてくださりありがとうございます。

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No.8257-4 - 2019/09/19 (木) 08:59:27 - も

TaKaRa は pause を押すと次の指定温度で停止しますが，abi は押したその時の温度をキープしてました。機種によって pause の定義が違いますね。10分経ったならどちらでもあまり変わらない気がします。高次構造をほどくための熱変性条件は55度10分，70度２分ならどちらもルーチンで用いています。70度10分が試薬の指定通りなら，十分に精製されたRNAに関しておそらく問題ないのでしょう。サーマルサイクラーの動作については簡単に確認できますね。ホットスタートと言うからには，RNAと H2O の他に何か入っているように読み取れます。どの試薬をお使いですか？

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No.8257-3 - 2019/09/19 (木) 03:02:23 - おお

もし、RTのため変性させているとしたなら、よほど癖があるターゲット出ない限りそのサンプルの状態でRTしてPCRに持ち込めるとはおもいます。あまり長時間のRNAの熱変性は好ましくないと思ってます。個人的には１０分も変性させません。

(無題)

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No.8257-2 - 2019/09/19 (木) 02:21:23 - おお

pauseを押してpauseを解除しなかったってことでしょうか？
いずれにせよ、あなたのサーマルサイクラーのマニュアルなどで確認してください。あなたのサーマルサイクラーや正確にどのボタンをおしたかなど分からずに答えるには正確な答えをしているか不安になります。どなたか周りにそのサーマルサイクラーを使っていてよくわかっている人はいないのですか？

雰囲気的には７０度あたりをキープしてたように思えます。でもそれってあなたが思っている感触と一緒で当てにならないから聞いているのですよね。

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No.8257-1 - 2019/09/19 (木) 01:11:58 - popo

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