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qPCRにおいて、Ct 35以上は信用できないのでしょうか？ トピック削除
No.8251-TOPIC - 2019/09/15 (日) 12:31:29 - qPCR
実験初心者です！質問させてください！
qPCRを行っていますが、興味ある遺伝子のサイクス数が35や38サイクル付近で立ち上がってきます。

デュプリケートでPCRを行なっていますが、当然ベータアクチンはそのデュプリケートでどちらも15付近に出てきますが、興味ある遺伝子は一方が32片方が37などとと、極端にずれることが多いです。

このずれの大きさは、立ち上がりのサイクル数が大きければ大きいほど、ズレていそうです。
一方、別の遺伝子は22や27、29などで上がってくる遺伝子に関してはデュプリケートでは全くズレません。

手技は丁寧な方だとは言われますので、テクニカルに片方のウェルだけ鋳型cDNAを少なくパイペットした、という可能性は、何度も試行しているのでないと思っています。

私がこれらの実験から得た印象である”立ち上がりのサイクル数が大きければ大きいほど、ズレるのは止むを得ない。その遺伝子は発現量がかなり低いため、信頼に値しない、その遺伝子には深追いしない”というのはみなさんと一緒でしょうか？

あるいは、プライマーの増幅効率が良いものを変えたらどうか？ということも考えてはいますが、各遺伝子につき複数個のプライマーを設計し、その中で最も得意的かつ、増幅効率の良いものを選んだので、まずは私の印象がコンセンサスなのかどうなのかをぜひお訊ねしたいです！

よろしくお願いします！
　
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(無題) 削除/引用
No.8251-3 - 2019/09/16 (月) 01:30:21 - おお
まず理想的なPCR条件では３５サイクルは１コピーが検出できるようなサイクル数です。

これぐらい濃度が低いと、サンプルをピペットで取ったときピペット内で１コピーあることも３コピーあることも、あるいはまったくない事もあるような状況になります。これがCt値に反映されますからブレが大きくなります。


＞信頼に値しない、その遺伝子には深追いしない
それは実験によります。１コピーでもある事が意味がある場合もあるだろうし、比較実験で片方のCtが２０サイクル代とか低いなら発現の上昇といえるし、発現がほとんどない事に意味があることもあるかもしれませんし。転写のNegative　Regulationを調べているヒトは、それはポジティブというかもしれません。

発現が非常に低かったというのは一つの結果なのでPublicationの再には他の遺伝子とともに結果を公表するのが科学的な姿勢の基本だと思います。

低発現 削除/引用
No.8251-2 - 2019/09/15 (日) 17:10:44 - かんちゃん
Ct値が大きいのは発現量が少ないことを示しているのは理解されているかと思われます。
そういったＣｔ値が大きい領域でのレプリケート間のブレは、以下のような対応を私でしたら行います。

1) テクニカルエラーができるだけ小さくなるようなＰＣＲ
　qPCRさんの実験条件は分かりかねますが、Ct値が小さくなるように下記を試みます。
　・RT-PCRであればRT時のinput RNAを増やす
　・効率がよいRT酵素へ変える（たとえばSuperScript IV Viloなど）
　・PCR時に、master mix に対するcDNA量を増やす（20microL+1microLから20microL+2microLなど）

2) 拾っているCt値が本当に見たいものを見ているかの確認
　・melt curve、どうですか？
　・non templateおよびnon RTのPCRでのCt値が出ていませんか
（発現量が低い関心遺伝子を測定していると思って、じつはprimer dimerだったとか...）

研究、うまくいくといいですね。

qPCRにおいて、Ct 35以上は信用できないのでしょうか？ 削除/引用
No.8251-1 - 2019/09/15 (日) 12:31:29 - qPCR
実験初心者です！質問させてください！
qPCRを行っていますが、興味ある遺伝子のサイクス数が35や38サイクル付近で立ち上がってきます。

デュプリケートでPCRを行なっていますが、当然ベータアクチンはそのデュプリケートでどちらも15付近に出てきますが、興味ある遺伝子は一方が32片方が37などとと、極端にずれることが多いです。

このずれの大きさは、立ち上がりのサイクル数が大きければ大きいほど、ズレていそうです。
一方、別の遺伝子は22や27、29などで上がってくる遺伝子に関してはデュプリケートでは全くズレません。

手技は丁寧な方だとは言われますので、テクニカルに片方のウェルだけ鋳型cDNAを少なくパイペットした、という可能性は、何度も試行しているのでないと思っています。

私がこれらの実験から得た印象である”立ち上がりのサイクル数が大きければ大きいほど、ズレるのは止むを得ない。その遺伝子は発現量がかなり低いため、信頼に値しない、その遺伝子には深追いしない”というのはみなさんと一緒でしょうか？

あるいは、プライマーの増幅効率が良いものを変えたらどうか？ということも考えてはいますが、各遺伝子につき複数個のプライマーを設計し、その中で最も得意的かつ、増幅効率の良いものを選んだので、まずは私の印象がコンセンサスなのかどうなのかをぜひお訊ねしたいです！

よろしくお願いします！
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