全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.8241-11 - 2019/09/13 (金) 22:45:00 - ちゅい ペリプラズムに溜める方法は、分子内S-S結合を積極的に作らせるような場合によくやる。細胞質は還元的環境なのにたいしてぺりぷらずむは酸化的だから折りたたみの時にs-sがつくられやすい。 GSTが分泌蛋白質という話は生まれてはじめて聞いた。細胞内のありふれた代謝酵素とかが、一部細胞表面や細胞外にもいたり、核に移行したり、というも話もときどき論文出るので、あるのかもしれないけど。

(無題) 削除/引用 No.8241-10 - 2019/09/11 (水) 23:49:30 - おお pGEX4T1 ごく普通に出回っている菌体内に発現させるベクターに みえます。

(無題) 削除/引用 No.8241-9 - 2019/09/11 (水) 13:42:34 - LB APさん、ペリプラズムと細胞質での発現との2通りということですね。 ペリプラズムでの発現というのは知りませんでした。 利点があるでしょうから、調べて見ますね、ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.8241-8 - 2019/09/11 (水) 12:54:59 - AP >人工的な分泌シグナルを持たせたタンパク質やMBPはLB培地中に分泌されるのでしょうか？私は過去にMBPの精製を行いましたが、その際も菌体から精製していました。 MBP融合系ベクターpMALには通常の細胞質内発現用のpMAL-cとペリプラズム発現用のpMAL-pがあります。先に書いたようにpMAL-pで発現しても通常培養中に培地に融合タンパク質が放出されるわけではないです。外膜を人為的な操作で破る必要があります。

(無題) 削除/引用 No.8241-7 - 2019/09/11 (水) 12:17:14 - ちき > 人工的な分泌シグナルを持たせたタンパク質やMBPはLB培地中に分泌されるのでしょうか？私は過去にMBPの精製を行いましたが、その際も菌体から精製していました。 だから、されないってみんな言っている。

(無題) 削除/引用 No.8241-6 - 2019/09/11 (水) 12:11:41 - LB みなさん、ありがとうございます！ ベクターは、pGEX4T1です！ やはり細胞内発現ですよね、、確認して良かったです。 人工的な分泌シグナルを持たせたタンパク質やMBPはLB培地中に分泌されるのでしょうか？私は過去にMBPの精製を行いましたが、その際も菌体から精製していました。

(無題) 削除/引用 No.8241-5 - 2019/09/11 (水) 11:59:24 - ちき ベクターの工夫で菌体外発現を実現するような系は見つけられませんでした(あるなら教えてほしい)。外膜透過性を持つstrainを使う、特殊な界面活性剤で処理する、グラム陽性菌を使うなどはあるみたいです。

(無題) 削除/引用 No.8241-4 - 2019/09/11 (水) 11:32:15 - おお 培地に放出されるような発現系は見たことがないのでちょっと調べたりと、、、 ちなみにその発現ベクターのバックボーンの名前は開示できますか？

(無題) 削除/引用 No.8241-3 - 2019/09/11 (水) 09:44:50 - AP よほど特殊な仕掛けがあるベクターじゃなければそういうことは起きませんね。 ペリプラズムに分泌させる発現系はあります。 細胞内に発現すると毒性があったり分解を受けやすいタンパク質には有効ですし、細胞を破砕しなくていいので夾雑物が極めて少ないという利点があります。しかし、これでも培養上清に自然に分泌されるわけじゃなくて、外膜や細胞壁をリゾチームや浸透圧で破ってやらないと放出されません。 それを考えると、よしんばそのGST融合タンパク質が細胞外に分泌されたとしても培養中に上清に放出されるということはないはずです。

(無題) 削除/引用 No.8241-2 - 2019/09/11 (水) 09:40:58 - mon 汎用されるGSTは細胞内タンパクです。 人工的に分泌シグナルを付けたか、MBPと間違えているのですかね。

LB培地に目的のタンパク質が検出されません 削除/引用 No.8241-1 - 2019/09/11 (水) 09:23:07 - LB ラボで昔樹立されたGSTを発現するBL21をLBプレートにまき、シングルコロニーを増やして、2 mlのスケールでIPTGによりタンパク質誘導を行ったところ、菌体からGSTのバンドが検出されました。 そこで100 mlのスケールにアップし、可溶性GSTを精製しようとしているのですが、上司はIPTGで誘導後に遠心し、菌体を回収する際、上清のLB培地も取っておくように、と言われました。 上司曰く、GSTは分泌タンパク質なのでLB培地中にもあるから、というのが理由です。 ただ私の理解ではGSTがsolubleであっても哺乳類細胞のように菌体外に分泌されるわけではなく、あくまで菌体の中でsolubleであって、界面活性剤や超音波処理しないとGSTは菌体から出てこないのではないか？と考えています・・・。 私の理解で正しいでしょうか・・・？

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---