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Q様 削除/引用 No.824-15 - 2012/08/13 (月) 17:08:10 - tahatty 再びご回答ありがとうございます。 先輩にどのくらい聞いてよいものか判断しかねておりました。 先輩自身も他の実験で多忙でいらっしゃいますし、 わからないことはできるだけ自分で調べるべきなのか、できるだけ先輩の指示を仰ぐべきなのか迷っておりました。 しかし、同じ実験をやる上でひとり条件の違うことをするのは均一な結果が得られないと困りますし、全体からの不信感にもつながるというのはよくわかります。 実験原理を理解したうえで、先輩と緊密に意思疎通を図る必要があるようです。 回答者様のご意見参考になります。

(無題) 削除/引用 No.824-14 - 2012/08/13 (月) 10:58:04 - Q 先輩等に質問しないで、自前でどっからか情報を仕入れた場合、 その情報が間違っていなければ、問題ないかもしれません。 問題なくても、自分だけ他のメンバーと違うことをやっていると、 自分勝手にやる奴と思われる、つまり、コミュニケーションを取らないと 周りの人が、何をやっているのかわからないヤツだと思い、 信用されないことがあるのです。 また、もし間違っていた場合、 それこそ、研究室のメンバーからは 「質問もしてこないし、自分勝手に訳が分からないことをやってる、 やつは信用できない」 となります。 そういう意味で、実際に先輩等に教えてもらうというのは、 「私は教えてもらっていますよ、この方法を用いてきちんとやりますよ」 という信用が得られるということもあるということです。 きちんと先輩等に聞きましょう。

KEN様 削除/引用 No.824-13 - 2012/08/13 (月) 07:13:47 - tahatty 丁寧なご回答有難うございます。 nano dropの波形はあまり意識していませんでした。 早く結果を出すのに必死になって、ひとつひとつの手順の意味を問うことが無かったと思います。 うまくいかないことには原因があるはずでしょうから、まずは今までのやり方を省みる必要がありそうです。 重ねてありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.824-12 - 2012/08/11 (土) 00:49:24 - KEN 先輩に相談しづらいですか？ 先輩が同じ実験をする人がいたら、横についてしっかりと技を盗んで下さい。 また、実験書をかりるか買ってみてはいかがでしょうか？ たとえば、羊土社は、色々な実験本を出しているので、それを見て勉強すると楽かもしれません。生協においてあると思います。 (流石に、最初からMolecular Cloningなんか読んでもさっぱりわからないでしょうし。。。) 抽出、PCRは全ての基本操作ですが、初心者だと陥りやすい失敗がたくさんあります。 ひと通りの操作を先輩についてもらって、指導してもらって下さい。 おそらくその様子ですと、他にもまずい点が多々あるかと思います。ボルテックスが不十分とか、ピペット操作がまずいとか、後輩を見ていると色々あります。一番、困るのは、増える頃ばかり気にして、コンタミにまで頭が回っていなかったり。。。 >>同じプロトコルに従って正しく増幅されたこともありました。 後輩で、プライマーダイマーをバンドだバンドだ！と言って見せに来た人がいました。。。先輩にデータを見てもらいましょう。 >>DNA抽出の最終段階として。。。 それよりも、前のステップは大丈夫ですか？経験上は、破砕とProK処理が不十分だとDNAが十分に取れません。 ProK処理は、時間キッチリというよりもサンプルの入れた量と溶け方で判断します。塊がゴポゴポ残っている状況では抽出しても失敗します。 先輩に見てもらいましょう。 >>spectrophotometerとagarose gel電気泳動でDNAの有無をチェックしています。 自分は、nano dropで測定しますが、ちゃんと吸光度比は確認していますか？ 濃度は105ng/ulと出ているかもしれませんが、波形がめちゃめちゃだとあてになりません。不純物の混入等も予測つきます。 詳しくは、吸光度比、蛋白、RNA、DNA等で調べて下さい。 ちなみに僕は、抽出段階での電気泳動でのチェックはしません。(サンプルがもったいないので) おまけ： 初心者にこういうことを言うのは不適切かもしれませんが、世の中には、便利なキットというものがたくさんあって、ネズミの尻尾でも抽出をすっ飛ばしたクルードサンプルでPCRがかけれたり、また、普通の抽出でもフェノクロせずにカラムでやっちゃう方法(QIAGENのDNeasyとか)手技は様々です。 自分のやっている実験は他にどういう方法で出来るのだろう？どういう原理？と調べてみると、トラブルシューティングの役に立つこともあります。 頑張ってください。

訂正 削除/引用 No.824-11 - 2012/08/10 (金) 10:57:25 - tahatty spectrophotometerで測定した濃度の単位は マイクロｇ/マイクロリットルでなく、ナノグラム/マイクロリットル の間違いです。

Harmonia様 削除/引用 No.824-10 - 2012/08/10 (金) 10:55:11 - tahatty Harmonia様 ご回答ありがとうございます。 確かに、DNAがあればODに反映されても、逆は成り立たないですね。 spectrophotometerの値をほぼ絶対的に捉えておりました。

(無題) 削除/引用 No.824-9 - 2012/08/10 (金) 07:40:55 - Harmonia トピ主さんがspectrophotometerでみているものはDNAだけでは有りません。 その波長を吸い取るもの（やや擬人的表現ですが)を全部見ています。 agarose gel電気泳動の印象とずれがあっても不思議ではありません。

ＴＳ様 削除/引用 No.824-8 - 2012/08/10 (金) 04:01:36 - tahatty TS様 ご回答ありがとうございます。 プライマーは確認済みです。同じプロトコルに従って正しく増幅されたこともありました。 もしDNAがフラグメント化してしまっていたというようなことがあっても、OD上は低濃度にはならないのでしょうか？ また、6倍希釈用loadin dyeを用いてゲルでの単一バンドを確認してきていたのですが… バンドになる断片長などを知らぬまま使っていました。調べ直します。

Ｑ様、Harmonia様 削除/引用 No.824-7 - 2012/08/10 (金) 03:39:04 - tahatty Q様、Harmonia様 ご回答ありがとうございます。 確かに、先輩から紙でいただいたプロトコルに従えばできるのだろうと考えておりました。 ひとつひとつの原理を理解した上で、うまくいっている人との違いを注意して見るべきですね。

BAC様 削除/引用 No.824-6 - 2012/08/10 (金) 03:32:40 - tahatty BAC様 迅速なご回答ありがとうございます。 エタノールを入れ遠心した後、いつも沈殿物らしいものが視覚的に確認できないため、どの程度まで上清をとったらよいのかわかりません。毎度DNAごと吸引廃棄してしまっているのではないかと疑っております。 しかし、皆様の言われるように、それ以外の原因も考える必要があるようです。

(無題) 削除/引用 No.824-5 - 2012/08/09 (木) 22:27:17 - Harmonia ネットの文字情報だけでお教えするのは難しいので、 うまくいっている人に実験操作を見てもらう もちろん うまくいっている人の実験操作を見てまねる でしょう。 たとえば、トピ主さんは書かれていませんが、 しっぽがどのくらい溶けたら（どのくらいの残渣までになったら）OK？ この長さのしっぽなら、沈殿の大きさはどのくらい？ というような、実際を見てみないと、説明されてもわからないステップが 有ります。 「どのくらい溶けたら」がDNA収量にとっては、けっこう大事な見極め ポイントですが、実際を見ていただかないと、また、経験をつんでないと 見極めが難しいです。 「まずは、先輩や先生に聞きなさい」 っていうのは、つきはなしてるとかそういうのでなく、説明したくても 説明しきれない「実物を見る」が入っていることからの言葉です。

(無題) 削除/引用 No.824-4 - 2012/08/09 (木) 22:02:05 - TS pcrがちゃんとかかってないだけでは？ プライマーの設計に問題ないことは確認済みでしょうか。 ODがちゃんとでてるのなら、dnaは取れてそうだけど。 dnaをアガロースゲルに流しても単一バンドとかは出ないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.824-3 - 2012/08/09 (木) 21:58:17 - Q 初心者は、文章で実験のことを理解することは難しいのです。 まずは、先輩や先生に聞きなさい。 先生や先輩に聞かないで、このようなネットで聞くのは良くありません。

(無題) 削除/引用 No.824-2 - 2012/08/09 (木) 20:54:01 - BAC こんばんは。 とりあえず、ラボの先輩やボスに聞けばいいと思うのですが…。 1)について 恐らくそこにDNAが回収できない原因は無さそうですが。 エタノール沈殿のやり方、原理から勉強して下さい。 原理も分からず実験すると、躓いた時に立ち上がれません。 2)について 吸光度の誤差でしょう。恐らく不純物のコンタミかと。 機械に使われる実験をしないで、機械を使いこなして下さい。 >>電気泳動でバンドが見られません。 PCR後の電気泳動もバンドが見られません。 つまりそういう事でしょう。DNAが回収出来ていないから電気泳動でも見えない。 PCRでも増えない。ここまで分かれば前に戻って考察出来るでしょう。 実験が失敗したら、一から疑ってかかってみて下さい。 ここは間違うはずがない。そういった考えが失敗の元です。

マウス尾からのDNA抽出 削除/引用 No.824-1 - 2012/08/09 (木) 19:00:12 - tahatty 今年度から生物系の研究室に入った実験初心者です。 マウスの尻尾からDNAを抽出してPCRする作業を行っていますが、毎度うまくいきません。 そこで、以下の質問へのご回答を希望しております。 1) DNA抽出の最終段階としてTEbufferを入れています。その直前に、70%エタノールを750マイクロリットル入れています。このエタノール上清は、デカント廃棄→spin down→マイクロピペットで吸引→乾燥　という処理にかけています。ここで、ピペットでどの程度まで吸引するのが適切なのでしょうか。いつもメニスカスが底につくくらいまで吸っていますが、うまくいきません。 2）spectrophotometerとagarose gel電気泳動でDNAの有無をチェックしています。前者ではDNA濃度が50〜150マイクログラム/マイクロリットルの値で出ますが、電気泳動でバンドが見られません。PCR後の電気泳動もバンドが見られません。理由としてどのようなことが考えられるでしょうか。 説明不足である点がございましたらご指摘ください。 ご回答お待ちしております。

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