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(無題) 削除/引用 No.8238-7 - 2019/09/11 (水) 21:48:20 - えsrftγy その抗原抗体複合体は可溶性ですか。大きな塊になると沈殿してしまい、通常の生化学的な分析には適しません。 その抗体とは別のエピトープを認識し、かつ動物種も異なる抗体があればELISAも可能と思います。同じ抗体だと既にエピトープはふさがっているので、ELISAでの検出はできません。また同じ動物種のIgG(または他のクラス）だと検出時に両方認識してしまうので無理です。 サンドイッチELISAの原理を勉強してもらえればわかると思います。

(無題) 削除/引用 No.8238-6 - 2019/09/10 (火) 11:30:50 - AP 抗体を殺すけど抗原は生き残る方法を考える。たとえ抗原が変性してしまったとしても抗原性が失われなければいいわけで、また多くのエピトープはタンパク質の変性の影響を受けない(じゃなきゃSDS-PAGEでイムノブロットなんかできない)。 例えば十分なボイル 変性剤や還元剤の使用(その後、必要に応じて、ゲル濾過などで変性剤とインムノグロブリン鎖を除く) 適当なプロテアーゼ処理 などなど

(無題) 削除/引用 No.8238-5 - 2019/09/10 (火) 10:13:40 - asan 抗体とビーズを化学的にクロスリンクとかしとけば一応酸での溶出はほとんどされないと思いますが、抗体によっては一部取れる可能性はありますね。 定量することが目的で、抗原に対する抗体がでかすぎてELISAでうまくサンドイッチできないというなら競合法とか、直接抗原タンパク質を固相化して抗体への蛍光二次抗体等で定量するとか定量法を工夫した方が現実的だと思います。

(無題) 削除/引用 No.8238-3 - 2019/09/10 (火) 01:38:16 - おお >pH 4くらいの弱めの酸で溶出をかければ、Protein Gと抗体は分離しないが抗体と抗原は分離し、 まず抗体と抗原が分離するか未知数ではないかな。 それに抗体がProteinGから全く溶出されないかどうかも不安が残る。 ＞共存する抗体がELISAを妨害しているので、 どういう状況かよくわからないです。抗体由来のシグナルがでて高く見積もられるということですか？ それとも抗体抗原の相互作用でELISA用の抗体がアクセスできずにシグナルが得られないということでしょうか？ Mさんが指摘されているように使われているELISAの種類もわからないのでどういう工夫が考えられるか以前の問題。

(無題) 削除/引用 No.8238-2 - 2019/09/10 (火) 00:41:09 - M サンプル内に共存する（自己？）抗体は、モノクロナールでしょうか、ポリクローナルでしょうか？ ELISAはサンドイッチですか？　サンドイッチで、プレートのコートからご自分でされているなら、補足抗体と検出抗体が手元にありますね。 サンプル内の抗体がモノクロで、それにより妨害されているのが、補足抗体との結合か、検出抗体との結合か分かれば、妨害されていない方の抗体でのウエスタンは可能なように思いますが、いかがでしょう？

抗原-抗体共存下での抗原の分離検出 削除/引用 No.8238-1 - 2019/09/09 (月) 23:28:11 - s_cana いつも参考にさせていただいております。初めて質問させていただきます。 ある抗原（タンパク質）とそれに対する抗体が共存したサンプルがあり、そこに含まれる抗原を定量したいと考えております。 これまで、この抗原の定量はELISAで行っておりましたが、上記のような抗体共存下のサンプルでは検出することができませんでした。抗体がELISAの検出を妨害しているためと考えております。 他の検出方法として、ウエスタンは利用可能な抗体がないため利用できません。また、MSでの定量は感度的に厳しいと考えております。そのため、なんとかELISAベースの方法で定量できないかと考えております。 共存する抗体がELISAを妨害しているので、どうにかして抗体と抗原を分離できないかというアプローチを考えております。 素人考えで、免疫沈降を模したような方法はどうだろうか、と考えました。抗原抗体複合体をProtein Gに結合させたあと、pH 4くらいの弱めの酸で溶出をかければ、Protein Gと抗体は分離しないが抗体と抗原は分離し、結果として抗原だけを抽出できるのではないか、というものです。 しかし、このような方法を記載した論文等は見つけることができず、また自分でも何度か検討してみましたが上手くいきませんでしたので、そもそものアプローチがおかしいのかなと思いつつあります。 知識不足で申し訳ないのですが、これ以上のアイデアがなく行き詰ってしまっております。なにか同様の状況における解決策や、根本的にアプローチが違うよ、など、助言を頂ければと存じます。 長文申し訳ありません。よろしくお願いいたします。

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