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異なるプライマーペアでのリアルタイムPCRの絶対定量値の比較 トピック削除
No.8220-TOPIC - 2019/09/05 (木) 06:07:45 - 初心者
すみません、最近リアルタイムPCRをはじめたばかりの初心者です。長文申し訳ありませんが、アドバイスをいただけましたら幸いです。

現在、木材や土壌中から採取したサンプル中に、菌類がどれぐらいいるのか、また、そのうち特定の菌（菌A）がどれぐらいの割合を占めるかを調べたいと考えています。

方法は、以下の2つのプライマーペアを用いて、インターカレーター法でリアルタイムPCRによる絶対定量を行い、その結果の値を比較してはどうかと考えました。

1:プライマーペア1（全菌類用で論文に掲載されていたもの）
2:プライマーペア2（菌A用の種特異的プライマーで自分で設計したもの）

PCR条件は、アニーリング温度が異なる以外は同じにしてあります。
それぞれ、ターゲットの配列を挿入したプラスミドを段階希釈して検量線を引いています。

しかし、実際の実験結果では、種特異的プライマーでの定量結果の値（計算したコピー数）が全菌類対象のプライマーの値を大きく上回ってしまうサンプルが出てしまいます。
特に、菌Aが多く含まれるサンプル（おそらく全体の菌のうちのほとんどを菌Aが占めているであろうサンプル）でその傾向があるように思います。

増幅効率は種特異的プライマーを使用した場合の方が若干高い傾向にあります。検量線のR2値は0.98以上です。

このような状態なのですが、原因や対処法について、どのように考えたら良いでしょうか。

やはり、種特異的プライマーペアの設計に問題があるため、再設計することを検討すべきでしょうか？
※現状でプライマーダイマーや非特異的増幅はほぼないです。

もしくは、同一サンプルの定量結果であっても異なるプライマーペアの結果比較することはできないのでしょうか？
※絶対定量なので定量に増幅効率は関係ないと思うのですが…

既出だったらすみません。
ご教示いただけましたら幸いです。
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.8220-5 - 2019/09/08 (日) 18:54:56 - 初心者
皆様

コメントありがとうございます。現状は下記のとおりです。
指導役の上司にも相談し、今後の進め方についてアドバイスをいただくようにしました。

→ちき様

ペア1の標的とペア2の標的のゲノム中数は同一です。
アドバイスいただきましたプラスミドを作成と定量ですが、指導役の上司にも相談して、施行してみることにしました。アドバイスありがとうございます。


→おお様

上司と相談しまして、今回使用したサンプル以外のサンプルで、各プライマーペアの過小・過大評価の可能性を検証してみることにしました。アドバイスありがとうございます。

→M様
サンプルを段階希釈しての定量結果ですが、スタンダードと同様の増幅効率がでていました。ただ、極端に薄いと効率が落ちてくるように思いました。正確な定量のためにも、希釈段階数を少なくして再検討してみたいと思います。
増幅産物の電気泳動やシーケンス結果からは偽遺伝子は拾っていないように思います。
アドバイスありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.8220-4 - 2019/09/05 (木) 15:59:56 - M
サンプルの希釈系列で増幅効率を見ると、プラスミドの場合と同等になりますか？

ペア2でpseudogenesを拾っている可能性はないですか？

(無題) 削除/引用
No.8220-3 - 2019/09/05 (木) 10:45:40 - おお
>1:プライマーペア1

これがUnderestimationなんだろうか。

(無題) 削除/引用
No.8220-2 - 2019/09/05 (木) 10:37:00 - ちき
絶対定量の経験があまりないので外しているかもしれませんが、、、

例えばペア1とペア2の標的配列を共に1コピーずつ持つプラスミドを作成して、それぞれのペアで定量したら結果は一致しますか。一致しない場合、このプラスミドを用いて検量線を引きなおしたら、(菌類を用いた)元の結果はどうなりますか。

あと基本的なことですが、ペア1の標的とペア2の標的のゲノム中コピー数は同一(もしくは既知で補正済)ですよね。

異なるプライマーペアでのリアルタイムPCRの絶対定量値の比較 削除/引用
No.8220-1 - 2019/09/05 (木) 06:07:45 - 初心者
すみません、最近リアルタイムPCRをはじめたばかりの初心者です。長文申し訳ありませんが、アドバイスをいただけましたら幸いです。

現在、木材や土壌中から採取したサンプル中に、菌類がどれぐらいいるのか、また、そのうち特定の菌（菌A）がどれぐらいの割合を占めるかを調べたいと考えています。

方法は、以下の2つのプライマーペアを用いて、インターカレーター法でリアルタイムPCRによる絶対定量を行い、その結果の値を比較してはどうかと考えました。

1:プライマーペア1（全菌類用で論文に掲載されていたもの）
2:プライマーペア2（菌A用の種特異的プライマーで自分で設計したもの）

PCR条件は、アニーリング温度が異なる以外は同じにしてあります。
それぞれ、ターゲットの配列を挿入したプラスミドを段階希釈して検量線を引いています。

しかし、実際の実験結果では、種特異的プライマーでの定量結果の値（計算したコピー数）が全菌類対象のプライマーの値を大きく上回ってしまうサンプルが出てしまいます。
特に、菌Aが多く含まれるサンプル（おそらく全体の菌のうちのほとんどを菌Aが占めているであろうサンプル）でその傾向があるように思います。

増幅効率は種特異的プライマーを使用した場合の方が若干高い傾向にあります。検量線のR2値は0.98以上です。

このような状態なのですが、原因や対処法について、どのように考えたら良いでしょうか。

やはり、種特異的プライマーペアの設計に問題があるため、再設計することを検討すべきでしょうか？
※現状でプライマーダイマーや非特異的増幅はほぼないです。

もしくは、同一サンプルの定量結果であっても異なるプライマーペアの結果比較することはできないのでしょうか？
※絶対定量なので定量に増幅効率は関係ないと思うのですが…

既出だったらすみません。
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よろしくお願いいたします。
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