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(無題) 削除/引用 No.822-11 - 2012/08/14 (火) 03:59:21 - 別に > これを知っていたのに。ここで質問して何を期待していたのでしょうか？質問に答えた方の時間が無駄に思えた。 あなたの時間が無駄になったわけではないのだから、よいのでは？ 質問箱ではないので、質問に答えるだけの場ではなくていろいろな情報がいろいろな人から発信されるのが、見ている人間にとっては有益です。 むしろ、いちいち文句を言っているだけのコメントは気分が悪くなるだけで無意味ですよね。

(無題) 削除/引用 No.822-10 - 2012/08/13 (月) 11:00:56 - 一体何？ ＞もともとあまり多くは採れないベクターみたいです。 これを知っていたのに。ここで質問して何を期待していたのでしょうか？質問に答えた方の時間が無駄に思えた。

(無題) 削除/引用 No.822-9 - 2012/08/10 (金) 17:22:27 - たらちゃん 抗生物質は大丈夫です。メーカーには以前問い合わせてみましたが、培養時間を長めにするのが良いと言われました。もともとあまり多くは採れないベクターみたいです。 それでもなんとか10ugとれ、クローニングに使用するには足りそうです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.822-8 - 2012/08/10 (金) 07:38:53 - ＋ メーカーに問い合わせてみましたか？ 聞こうよ。

(無題) 削除/引用 No.822-7 - 2012/08/09 (木) 22:24:05 - いくらちゃん 抗生物質は本当に正しいですか？ 私が把握しているだけでも、gateway系のベクターの選抜にはアンピシリン、カナマイシン、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンを使うものがあります。 少ないながらも回収できたプラスミドは本当に求めるプラスミドかどうかの確認はできていますか？ それから、一番やっかい、というかひどいのは、昔のmultisiteのdestination（R4-R3r？）はccdBに変異があるとかで、現在invitrogenから市販されているccdB耐性大腸菌では増幅できません。

(無題) 削除/引用 No.822-6 - 2012/08/09 (木) 22:13:13 - Harmonia 概してコロニーが小さい傾向があるので、菌の育ちが悪く取れにくいのが 普通かもしれないです。 また、ccdB遺伝子保有クローンを増幅する際の注意点が Invitrogen (Life Technologies 社）のウェブサイトにあります。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * Q GatewayデスティネーションベクターなどccdB 遺伝子を持つベク ターをOne Shot ccdB Survival 2 T1R cells (Cat.# A10460) で 増やす際に注意する点はありますか？ A 大腸菌内での増幅により、ccdB 遺伝子に変異が入り、毒性が低 下、あるいは無くなる可能性があります。よって、変異導入を抑え るため、培養は低温（25〜30℃）で行い、またLBなどあまりリッチ ではない培地のご使用をお奨めします。 また、精製プラスミドを一度DH5α、TOP10などccdB 感受性株に導 入していただき、どの程度コロニーが出現するか（バックグラウン ド）をチェックしていただく必要があります。 （この記事は、直リンできないので、 https://www3.invitrogen.jp/form/FAQ/index.php のメニューから「Gateway Cloning」から引用しています。） * * * * * * * * * * * * * * * * * * ↑増幅のための培養は37℃ではなく25〜30℃をお勧めしてます。

問題は起きているの？ 削除/引用 No.822-5 - 2012/08/09 (木) 15:54:22 - ~ Gatewayのベクターシリーズでは様々なoriが使われていますよね。 >InvtrogenのGatewayシステムで使用するccdB耐性遺伝子を持つベクター >ccdB遺伝子を持たない他のプラスミド それぞれのコピー数とベクターサイズはいくつなのでしょうか？ その回答次第では、他のプラスミドの1/10以下の収量は妥当かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.822-4 - 2012/08/09 (木) 11:30:15 - 産むが易し 悩むより 数をこなした 方が速い 心の俳句

(無題) 削除/引用 No.822-3 - 2012/08/09 (木) 11:24:28 - たらちゃん すみません、LB培地です。 アンピシリンは終濃度50μg/ml、クロラムフェニコールは終濃度20μg/mlで行っています。 最初クロラムフェニコールなしで培養していましたが、抽出してみると他のプラスミドより少なく1/10も採れなかった気がします。菌液は濁っていましたので、増幅できていると思ったのですが…。 TB培地、試してみようと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.822-2 - 2012/08/09 (木) 10:54:25 - mon LA培地は、LB培地の間違いでしょうか？ アンピシリンとクロラムフェニコールの使用濃度は？ 培養後得られた菌体量は、ccdB遺伝子を持たない他のプラスミドと比べて少ないでしょうか？ TB培地などで菌体数を増やす、クロラムフェニコール濃度を2.0-5ug/mlまで下げるとplasmid収量が上がることがあります。精製法は関係ありません。

ccdB遺伝子を含むプラスミドの増やし方について 削除/引用 No.822-1 - 2012/08/09 (木) 10:44:39 - たらちゃん InvtrogenのGatewayシステムで使用するccdB耐性遺伝子を持つベクターを増やすことができずに困っています。 ccdB遺伝子耐性の大腸菌に形質転換し、菌は生えるのですが、コロニーをピックアップして液体培地で培養後、プラスミド抽出しても収量が極めて少ないです。培地はLA培地にアンピシリンとクロラムフェニコールを添加しました。培養は37℃で1晩行っています。 ccdB遺伝子を持たない他のプラスミド等では、形質転換したくさんプラスミドを抽出することができています。 プラスミド抽出はQIAGENのOIAfilter mid kitを使用しています。 菌の増殖が遅いのでしょうか？ それとも精製法を変えてみた方が良いのでしょうか？ どうかご教示ください。 よろしくお願いします。

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