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mRNA発現量の低い遺伝子のqPCR解析（検量線法） トピック削除
No.82-TOPIC - 2012/01/25 (水) 17:08:02 - rama
先日は96ウェルプレートへの溶液の分注に関してご助言頂きどうも有難うございました。
度々連続して恐縮なのですが、qPCRに関してご相談させて下さい。

ハウスキーピング遺伝子にGAPDHを用い、種々の遺伝子のmRNA発現量をqPCR解析（検量線法）しているのですが、ある遺伝子（遺伝子Aとする）のmRNAの発現が非常に低く（融解曲線分析ではGAPDHの1/2以下の蛍光シグナルを示している）、正確な定量が出来ずにいます。

希釈系列は4倍で5段階のスタンダードを作成し、6点で検量線を作成しているのですが、GAPDHおよびその他の遺伝子は決定係数0.98以上、増幅効率ほぼ100%，傾きも良好であるのに対し、遺伝子Aは右上がりの傾きで増幅効率は非常に低くなってしまいます。

融解曲線分析をすると、発現量が少ない or 鋳型濃度が低い（検量線用希釈Sample）ものは特に、プライマーダイマーが発生しています。

機器はTaKaRaのThermal Cycler Diceを使用し、酵素は同じくTaKaRaのSYBR Premix Ex Taqを使用しています。

PCR条件は以下の通りで、

Template：100 ng
Primer濃度：0.4 μM

Hold
Cycle：1
95 ℃，30 秒

2 Step PCR
Cycle：40
95 ℃，5 秒
60 ℃，30 秒

反応特異性を上げるためにアニーリング温度をTaKaRa推奨の温度の最高ライン（64 ℃）まで上げると、GAPDHが全く発現しなくなり、プライマー濃度をTaKaRa推奨の濃度の最低ライン（0.2 μM）まで変更してもプライマーダイマーの生成で3点目以降の検量線が引くことが出来ない結果となっています。

諸事情で、プライマー自体は変更不可なので、それ以外でプライマーダイマー形成による解析の阻害を防ぐ方法がございましたら是非ご助言頂ければ幸いです。

※その他の論文では、他社の機器を用いて

【論文A】
Cycle：1
95 ℃　3 min

Cycle：50
95 ℃ 30 sec
59 ℃ 30 sec

【論文B】
Cycle：1
95 ℃ 10 min

Cycle：40
95 ℃ 15 sec
60 ℃ 1 min

の条件で行っていました。

ここまで長々とお読み頂きどうもありがとうございます。
どうぞよろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.82-5 - 2012/01/26 (木) 06:44:05 - ｋ
塩化マグネシウムを足すというのが、通常のＰＣＲでは対策ですが、リアルタイムＰＣＲでは現実的ではない対策でしょうか？

(無題) 削除/引用
No.82-4 - 2012/01/25 (水) 21:44:44 - qPCR
先に聞き忘れていたのですが、

なぜ、
>諸事情で、プライマー自体は変更不可
なのでしょうか？
超特別な理由でもあるのでしょうか？

プライマーダイマーができた場合、
プライマーを再設計するのが一番早いし
一番いい方法だと思うのですが。


ちなみに、話は変わりますが、
リアルタイムPCRの場合でも、
解析遺伝子が違えば、同じPCRプレートで反応する必要はないので、
解析遺伝子ごとに、別々のPCRプレートを使って、PCR条件を変えても問題無いです。

(無題) 削除/引用
No.82-3 - 2012/01/25 (水) 18:07:03 - rama
御回答どうもありがとうございます。

> その論文Ａと論文Ｂでは、どの試薬を使っていたでしょうか？

【論文A】
・SuperScript III Two-step aRT-PCR with SYBR Green Kit（Invitrogen）
・iCycler IQ detectionn system（Bio-Rad）

【論文B】
・TaqMan Unibersal PCR Mater Mix（Roche）
・ABI PRISM 7900HT Swquence Detection System（Applied Biosystems）

上記の試薬を使用しているようです。
出来れば現在使用している試薬からこれらの試薬にシフトすることは避けたいのですが、最終手段としては考えるべきかもしれません。

また論文Bには具体的な記述はありませんでしたが、論文AではΔΔCt法を採用していました。

(無題) 削除/引用
No.82-2 - 2012/01/25 (水) 17:49:42 - qPCR
RT-qPCRは、通常の半定量RT-PCRと比べて
PCR溶液に結果が大きく依存します。

理由は、PCR溶液の組成が、各社違うので、
同じプライマー、同じ機器を使っていたとしても、
PCR溶液が違えば、反応がうまくいかないという事も多いです。

逆に言えば、
同じプライマー、同じPCR溶液を使うと
機器が違っていても、結果が再現される可能性は高くなります。

その論文Ａと論文Ｂでは、どの試薬を使っていたでしょうか？

mRNA発現量の低い遺伝子のqPCR解析（検量線法） 削除/引用
No.82-1 - 2012/01/25 (水) 17:08:02 - rama
先日は96ウェルプレートへの溶液の分注に関してご助言頂きどうも有難うございました。
度々連続して恐縮なのですが、qPCRに関してご相談させて下さい。

ハウスキーピング遺伝子にGAPDHを用い、種々の遺伝子のmRNA発現量をqPCR解析（検量線法）しているのですが、ある遺伝子（遺伝子Aとする）のmRNAの発現が非常に低く（融解曲線分析ではGAPDHの1/2以下の蛍光シグナルを示している）、正確な定量が出来ずにいます。

希釈系列は4倍で5段階のスタンダードを作成し、6点で検量線を作成しているのですが、GAPDHおよびその他の遺伝子は決定係数0.98以上、増幅効率ほぼ100%，傾きも良好であるのに対し、遺伝子Aは右上がりの傾きで増幅効率は非常に低くなってしまいます。

融解曲線分析をすると、発現量が少ない or 鋳型濃度が低い（検量線用希釈Sample）ものは特に、プライマーダイマーが発生しています。

機器はTaKaRaのThermal Cycler Diceを使用し、酵素は同じくTaKaRaのSYBR Premix Ex Taqを使用しています。

PCR条件は以下の通りで、

Template：100 ng
Primer濃度：0.4 μM

Hold
Cycle：1
95 ℃，30 秒

2 Step PCR
Cycle：40
95 ℃，5 秒
60 ℃，30 秒

反応特異性を上げるためにアニーリング温度をTaKaRa推奨の温度の最高ライン（64 ℃）まで上げると、GAPDHが全く発現しなくなり、プライマー濃度をTaKaRa推奨の濃度の最低ライン（0.2 μM）まで変更してもプライマーダイマーの生成で3点目以降の検量線が引くことが出来ない結果となっています。

諸事情で、プライマー自体は変更不可なので、それ以外でプライマーダイマー形成による解析の阻害を防ぐ方法がございましたら是非ご助言頂ければ幸いです。

※その他の論文では、他社の機器を用いて

【論文A】
Cycle：1
95 ℃　3 min

Cycle：50
95 ℃ 30 sec
59 ℃ 30 sec

【論文B】
Cycle：1
95 ℃ 10 min

Cycle：40
95 ℃ 15 sec
60 ℃ 1 min

の条件で行っていました。

ここまで長々とお読み頂きどうもありがとうございます。
どうぞよろしくお願い致します。
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