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(無題) 削除/引用 No.818-10 - 2012/08/08 (水) 10:57:18 - qq ＞検出できないとは、完全に「真っ白」ということでしょうか？ と、聞かれて、 ＞真黒の背景にバンドが検出されていない状態です。 ＞アクチンは白いバンドが検出されます。 とのお答え、何か話がかみ合っていないような感じです。 WCLさんは、CCDカメラなどで化学発光シグナルをホワイトのバンドとして検出しているのですか？それともX線フィルムに露光させて、シグナルを黒のバンドに検出しているのですか？

(無題) 削除/引用 No.818-9 - 2012/08/08 (水) 10:35:22 - TS サンプルのタンパク質濃度を同じ方法で測定しているのであれば（1 wellあたりのLysis buffer量など）、どちらのbufferでより多くのタンパク質を抽出しているかすぐにわかりませんか。 たとえばSDSを使った場合は、濃度がいつもの1.5倍になるとか。

(無題) 削除/引用 No.818-8 - 2012/08/08 (水) 10:00:17 - ~ > そうした（1ウェルあたりの目的タンパク質量が減り、検出限界以下になった）場合、どうしたら検出できるようになりますでしょうか。 目的たんぱく質の量を増やすか、検出感度を上げるかの2択でしょうか。 前者 ウェルに乗せるたんぱく質量を増やす。 IPで濃縮する。 抽出方法を変更する。 後者 フィルムにあてて一晩置いてみる。 感度の高い試薬で検出する。 高感度フィルムで検出する。 ELISA等の別の検出系を使う。

(無題) 削除/引用 No.818-7 - 2012/08/08 (水) 09:17:41 - WCL 〜さま　Qさま ＞1ウェルあたりのタンパク質濃度が同じになるようにアプライして検出しているのであれば、SDSを入れたことにより得られるタンパク質量（および濃度）が増加し、1ウェルあたりの目的タンパク質量が減り、検出限界以下になった は成立するかと思います。 理解できます。 そうした（1ウェルあたりの目的タンパク質量が減り、検出限界以下になった）場合、どうしたら検出できるようになりますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.818-6 - 2012/08/08 (水) 09:14:01 - ~ >１％SDSを添加したlysis Bufferで細胞を溶解したサンプルで、Actinは検出できております。 アクチンの量はSDS±で変わらない（または同じになるように補正をかけている）のでしょうか？ 1ウェルあたりのタンパク質濃度が同じになるようにアプライして検出しているのであれば、 SDSを入れたことにより得られるタンパク質量（および濃度）が増加し、1ウェルあたりの目的タンパク質量が減り、検出限界以下になった は成立するかと思います。

(無題) 削除/引用 No.818-5 - 2012/08/08 (水) 08:12:07 - Q SDSを加えたことで効率よくタンパク質が溶解されることで、タンパク質濃度がより高くなりアプライしているタンパク質量が多すぎてうまくworkしていないのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.818-4 - 2012/08/07 (火) 22:00:24 - チンコ 通常の方法で検出できているならば変法を取る必要はないのでは。しっかりホモジナイズ出来ていますか？ソニケーションしょりのほうがいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.818-3 - 2012/08/07 (火) 18:07:28 - WCL Qさま 返信ありがとうございます。 真黒の背景にバンドが検出されていない状態です。 アクチンは白いバンドが検出されます。

(無題) 削除/引用 No.818-2 - 2012/08/07 (火) 17:33:39 - Q 検出できないとは、完全に「真っ白」ということでしょうか？

Whole cell lysateでのタンパク検出 削除/引用 No.818-1 - 2012/08/07 (火) 15:48:43 - WCL いつもお世話になっております。 ある内在性のタンパクを検出するのに、 １％SDSを添加したlysis Bufferで細胞を溶解し、ホモジナイズした後、sample bufferを添加し、WBを行いました。 通常は、SDSを添加していないlysisBufferで溶解し、遠心し核を除いた後にsample bufferを添加し、WBを行っています。 通常の方法（SDSを添加していないlysisBufferで溶解した場合）では検出できる内在性のタンパクが、１％SDSを添加したlysis Bufferで細胞を溶解した場合では検出できませんでした。 なお、１％SDSを添加したlysis Bufferで細胞を溶解したサンプルで、Actinは検出できております。 なぜ検出できないか御教授いただけましたら、幸いです。 よろしくお願い致します。

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