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空ベクターなのに増えない トピック削除
No.8154-TOPIC - 2019/08/11 (日) 23:44:37 - 小並
いつも勉強させてもらっています。さて、早速ですが質問です。

自分用ストックのpGEXベクターが減ってきたため、大腸菌(DH5α)に形質転換して再度増やそうとしています。
これと並行して、とある遺伝子をライゲーションしたものを形質転換しました。
空ベクターは無数にコロニーが生え、ライゲーションしたものは100個ほどでしょうか、それなりに生えました。
それぞれ爪楊枝でつついて液体培養したのですが、以下のことが起きました。

@空ベクターとライゲーションしたもの、どちらも大腸菌は順調に増えたのですが、miniprepで50ul抽出後、ライゲーションしたものは250ng/ul取れたのにもかかわらず、空ベクターは80ng/ulしか取れなかった。
Aライゲーションしたものは約5000(pGEX)+1000(目的遺伝子)bpの位置にバンドが見られたが、空ベクターはなぜか10000bpの位置にバンドが存在した。

これだけ見ると、元の空ベクターが本当にpGEXなのかとなりますが、ストックを電気泳動で流すと確かに5000bpの位置にバンドがあります。
何が起こっているのでしょうか。皆様の知恵をお貸しください。
　
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No.8154-5 - 2019/08/13 (火) 00:40:40 - おお
何が起こっているのか不可解なことは確かにたまに起きるのですが、コンピの大腸菌の株を変えるとか、関係あるかどうかわからない変更でうまくいくこともあります。

制限酵素は違うものを試しましたか？

また切れたプラスミドと環状のものとではバンドの形状が少し違うのでそういうところからなにか考えられることはありますか？

(無題) 削除/引用
No.8154-4 - 2019/08/12 (月) 22:09:23 - TAKE
>過去のスレッドで、個体培地をかき取ってそこから抽出してみたらというアドバイスを見かけたのですが、高温で溶かすんですかね…？


いえ、LB培地に2-3mlの液体LBを加え、スクレイパーで表面を優しくなぞり、大腸菌を掻き取る感じです。

(無題) 削除/引用
No.8154-3 - 2019/08/12 (月) 21:04:36 - 小並
ユコさん
「何が起こっているのでしょうか（小並感）」です、まさに、はい。

バンドは２種類の制限酵素で切断しています。
正確に書くと、4000bpの位置と1000bpの位置に１本ずつバンドが得られるとpGEXが確認できるのですが、
空　10000bpに１本
ライゲーション　4000+2000(1000+インサート1000)bpの位置に２本現れる
となります。
間違いなくpGEX以外の何かが得られているのですが、コンタミしていた場合は、10000bpのものは何が取れているのか…ゲノム…？
コロニーは１つです。プラスミドは同量用いています。

他の人の培地を借りてやり直しましたが、また同じものが得られ、単なるコンタミとは思えません。
この時も、大腸菌のみを蒔いたものはコロニーが出ず、形質転換したものは無数のコロニーが得られました。

過去のスレッドで、個体培地をかき取ってそこから抽出してみたらというアドバイスを見かけたのですが、高温で溶かすんですかね…？

(無題) 削除/引用
No.8154-2 - 2019/08/12 (月) 02:47:46 - ユコ
小並感満載なトピックですね。
冗談です。すみません。

2に関してですが、このバンドというのは、制限酵素カットしたものを流しているということですか？

1に関してですが、コロニーは一つだけピックされたのでしょうか？
また、形質転換時にはその二つとも同じ量のプラスミドを形質転換されましたか？
無数と100が気になります。もしかしたらエンプティベクターの方に何かのコンタミが生じており、抗生剤では死なない何かが生えてきているのかもしれませんね。

私はLBがよくコンタミします。
2週間も4度に放置すればなにやら濁ってきます。
それに気付かず形質転換をそれを用いて行うととんでもないことになります...

空ベクターなのに増えない 削除/引用
No.8154-1 - 2019/08/11 (日) 23:44:37 - 小並
いつも勉強させてもらっています。さて、早速ですが質問です。

自分用ストックのpGEXベクターが減ってきたため、大腸菌(DH5α)に形質転換して再度増やそうとしています。
これと並行して、とある遺伝子をライゲーションしたものを形質転換しました。
空ベクターは無数にコロニーが生え、ライゲーションしたものは100個ほどでしょうか、それなりに生えました。
それぞれ爪楊枝でつついて液体培養したのですが、以下のことが起きました。

@空ベクターとライゲーションしたもの、どちらも大腸菌は順調に増えたのですが、miniprepで50ul抽出後、ライゲーションしたものは250ng/ul取れたのにもかかわらず、空ベクターは80ng/ulしか取れなかった。
Aライゲーションしたものは約5000(pGEX)+1000(目的遺伝子)bpの位置にバンドが見られたが、空ベクターはなぜか10000bpの位置にバンドが存在した。

これだけ見ると、元の空ベクターが本当にpGEXなのかとなりますが、ストックを電気泳動で流すと確かに5000bpの位置にバンドがあります。
何が起こっているのでしょうか。皆様の知恵をお貸しください。
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