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アドバイスをありがとうございました 削除/引用 No.815-12 - 2012/08/07 (火) 09:36:36 - Mary ＞タンパク質を取り扱う場合、一般的にという話をするのは難しいと思います。 そうですね。自分の中でも目的のタンパクごとに色々と条件を変えているので、それはすなわち一般化しにくいということですよね。 ＞結果だけを聞かされると、はっきり言って第３者には、何が起こっているのかわかりません。 私の所属する小さなラボでは、自作の暗室でX線フィルムをつかって現像しています。そもそもX線フィルムをスキャナで取り込んで解析する方法自体、CCDイメージャーに比べると感度が低いかもしれません。 凍結融解したサンプルや、抗体濃度を下げて長く露出して現像することにより、感度が上がるように感じられることもあるのですが、 フィルムをもとに、ディスカッションいたします。

数々の貴重なアドバイスをありがとうございます 削除/引用 No.815-11 - 2012/08/07 (火) 09:25:19 - Mary ＞自分はボイルでシグナルが減弱したと感じたことはありません。 ＞やはり凍結融解が主原因でしょう。 ＞それに、毎回ボイルする必要もないのでは？ ＞加熱処理は始めに１回しておけば、以降は不要。ていうか融解のたびに加＞熱繰り返してるなら還元剤がかなり蒸発してるんじゃね。 還元剤の蒸発はかなりありそうです。今後 ボイルは調整時のみの1回にすることにします。 以前は1回だけだったのですが、 凍結保存後融解すると、SDSが析出したような白い固形物が出てきて サンプルのアプライがやりにくいので、 毎回ボイルする方法に変更しました。 （「毎回ボイル」は、購入したポジネガ（Cell Extract)のデータシートに習って） ＞抽出液ストックだって、凍結融解を繰り返せばシグナル強度は減っていき＞ませんか？ ＞もし減らないのなら、毎回抽出液ストックからサンプルを作るのが一番良＞いと思う。 ＞（サンプルは）基本的には１回ですが、結果次第でやり直すので１〜２回＞ですね。 ＞翌日使う時は、サンプルによって凍結したり、4℃で保存したり。 ＞対策として、はじめにSDS-PAGE sampleを調製したら、少量づつ分注して使＞い切りで凍結保存したらどう。 今後は基本的に使い切りのつもりでSDSサンプルを 少量分注しようと思います。 これまでに、サンプルの凍結融解によってシグナルが減弱するか 確かめたこともあったのですが、そのときは差がなかったので、 何も気にせずに凍結融解を繰り返し行ってきました（〜10回）。 （このため、抽出液ストックは逆に凍結融解はほとんどしていません。） よくよく考えてみると、ECLからECLPrimeに変更（これに伴う抗体濃度の変更）、目的のタンパクが違うなど、多くの条件が以前とは変わってきているので、以前大丈夫だったから、今も大丈夫とはいえません。 私の働くラボは小さな私立大学の小さなラボ（修士生もほとんどいない）のため、ディスカッションは主に教授とのみなので、 色々なアドバイスをいただけて、本当に助かりました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.815-10 - 2012/08/07 (火) 08:37:21 - う 話の腰を折るようで恐縮ですが、 質問のなかに、「一般的にはどうか」とおっしゃっていますが、 質問者様も書いておられるように「自分のタンパク質は300kDaであるので」 と。 タンパク質を取り扱う場合、一般的にという話をするのは難しいと思います。 なので、自分が取り扱っているサンプルで見られて現象を注意深く観察することが 最も有効な策かと思います。 ただ、一般的に難しいとは、タンパク質に対してであって、 実験に使用している化学物質についての性質には言及出来ると思いますので コメントしますが、 ＞SDSサンプルバッファーを入れてサンプルを作ると、 もとのシグナル強度に戻ります。 この情報から、タンパク質が分解しているわけではないということが 言えると思います、 ということは、プロテアーゼの存在ではないということかと。 そして、サンプルバッファーの再添加によって戻るということは、 数回のボイルによる取り返しのつかないタンパク質の凝集でもないということかと。 さらに、再添加によってもどるということは、 サンプルバッファー中の必要な物質がまた添加されれば、もどるという推定ができると 思います。と、いうことは、 サンプルバッファーの組成の中で、失活をすると思われる還元剤が原因ではないかと 考えられるのではないでしょうか。 しかしながら、 ＞あるいは、サンプルが新しくシグナルが強いときよりも 何度か凍結融解したサンプルの方が、ダイナミックレンジが広がり、検出感度が上がったように感じられることもあります。 結果だけを聞かされると、はっきり言って 第３者には、何が起こっているのかわかりません。 ＞どの実験結果を使うか迷うことがあります。 同じグループ内で実際にディスカッションされることをお勧め致します。

(無題) 削除/引用 No.815-9 - 2012/08/06 (月) 23:04:12 - (゜Д゜ 可能性としてはレアケースかもしれないけど、SDS＆boilingでも完全に失活しないようなおそろしくタフなproteinaseも数ある酵素のなかにはあるらしいから、そういうのの活性が非常に高い試料だと分解の可能性もゼロではないかもしれない。 対策として、はじめにSDS-PAGE sampleを調製したら、少量づつ分注して使い切りで凍結保存したらどう。

(無題) 削除/引用 No.815-8 - 2012/08/06 (月) 22:41:43 - (゜Д゜ 還元剤の作用が低下して一部再酸化が起きている可能性があると思うんだが、どうよ。そうすると分離が悪くなったり高分子量側にスメアになったりして、シグナルが不明瞭になるよ。特にこれ分子量おおきいみたいだから、ランダムな分子内：分子間のS-Sの再酸化でアグリゲーションしたらゲルのトップやウェル底あるいはゲルに入らないとかみたくなるんじゃね。 こんなときは、あらたに還元剤追加すると元のきれいなパタンに戻る事多い。betaMEは比較的安定だけど、それでも凍結融解繰り返して繰り返し空気にさらしていれば効果は徐々に減弱してくる。抗体によっては分子内S−Sがちゃんと切断されて完全に変性してないと上手く認識しにくいものもある。 加熱処理は始めに１回しておけば、以降は不要。ていうか融解のたびに加熱繰り返してるなら還元剤がかなり蒸発してるんじゃね。

(無題) 削除/引用 No.815-7 - 2012/08/06 (月) 21:41:02 - 直輝 ＞その抽出液ストックから新たに ＞SDSサンプルバッファーを入れてサンプルを作ると、 ＞もとのシグナル強度に戻ります。 抽出液ストックだって、凍結融解を繰り返せばシグナル強度は減っていきませんか？ もし減らないのなら、毎回抽出液ストックからサンプルを作るのが一番良いと思う。

(無題) 削除/引用 No.815-6 - 2012/08/06 (月) 21:37:20 - 直輝 ＞もしくは、使用前に行う毎回の4分ボイル？ 自分はボイルでシグナルが減弱したと感じたことはありません。 やはり凍結融解が主原因でしょう。 それに、毎回ボイルする必要もないのでは？ ＞一般的に、SDSサンプルバッファーに溶解してサンプルを作ってから、 ＞皆様は何回くらい使用されていますか? 基本的には１回ですが、結果次第でやり直すので１〜２回ですね。 翌日使う時は、サンプルによって凍結したり、4℃で保存したり。 サンプルに含まれるプロテアーゼの量とか、目的タンパクの丈夫さによってシグナルの減弱具合も変わるんでしょうね。 ちゃんと検証したことはないけど。

一般に何回くらいまで使用できるのでしょうか? 削除/引用 No.815-5 - 2012/08/06 (月) 17:36:25 - Mary コメントをありがとうございます。 同じサンプルを繰り返し使うと、 シグナルが減弱するのですが、 場合によってはノンスペも下がるので、 目的のタンパクをきれいに検出できる場合もあります。 あるいは、サンプルが新しくシグナルが強いときよりも 何度か凍結融解したサンプルの方が、ダイナミックレンジが広がり、検出感度が上がったように感じられることもあります。 しかしながら、サンプルが劣化しているのであれば、 真の実験結果を見失う可能性もあると思うのです。 群間に明らかな差があればそのような影響はマスクできると思うのですが、 差があまりない場合、どの実験結果を使うか迷うことがあります。 一般的に、SDSサンプルバッファーに溶解してサンプルを作ってから、 皆様は何回くらい使用されていますか? （また、現在測定しているタンパクは比較的大きい（280ｋDa）ため、 より劣化しやすいということはあるのでしょうか？）

(無題) 削除/引用 No.815-4 - 2012/08/06 (月) 14:17:41 - Q >その原因は凍結融解を繰り返すことが原因でしょうか? それとも、サンプル調整してからの経過時間？ もしくは、使用前に行う毎回の4分ボイル？ 全部。

タンパク量は同じです 削除/引用 No.815-3 - 2012/08/06 (月) 13:06:53 - Mary コメントをありがとうございます。 サンプルの濃度は測定しており、 すべてのサンプルの濃度を統一しています。 そのため、タンパク量およびApplyは同じです。

(無題) 削除/引用 No.815-2 - 2012/08/06 (月) 12:57:10 - Harmonia 仰っているシグナルが弱くなる現象は、 　　まさしくそのメンブレンに乗っかっているタンパク量が変わらない 　　にも関わらず、 か、 　　毎回おなじ液量（つまり乗っかっている目的タンパク質の量は不明 のどちらで起きますか？ 考えられることを絞り込むために必要な情報です。

ウエスタン　サンプルの劣化について 削除/引用 No.815-1 - 2012/08/06 (月) 10:55:59 - Mary ウエスタンに用いるサンプルバッファーに溶解したサンプルが、 劣化（シグナルが弱くなる）するようなのですが、 その原因は凍結融解を繰り返すことが原因でしょうか? それとも、サンプル調整してからの経過時間？ もしくは、使用前に行う毎回の4分ボイル？ 組織（ラット肝臓）を抽出バッファーで抽出しています。 その抽出液ストックから新たに SDSサンプルバッファーを入れてサンプルを作ると、 もとのシグナル強度に戻ります。

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