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(無題) 削除/引用 No.8144-4 - 2019/08/09 (金) 15:09:55 - asan totalRNA量で補正をかけてる時点で菌量で補正する意味は大分なくなるとおもいますけどね。 totalRNA量で揃えてからハウスキーピング遺伝子で定量を取るのはあくまで慣例的なものだとは思いますが、おそらくqPCRはWBなどと比べてもかなり感度が高いし、比較的微妙な違いも拾ってしまうのでサンプル間のズレを減らすために一般的に行うというだけの話だと思います。実際、totalRNA量を揃えるのは逆転写RNAの量が極端に違うのがよくないとか、逆転写に持ち込むRNA量が飽和してないことを保証する意味合いが強いと思います。微量サンプルを扱う場合は、共沈材などを混ぜて全量逆転写反応に回す方法はよく取られます。 また、当然特定のハウスキーピング遺伝子の発現量が細胞種類が大きく異なる場合に同じである保証もないので、tissue間での比較をするときなんかはハウスキーピング遺伝子を何にするかでも結構変わってくるのであまりあてになりません同じように、RNAseqなどの多重比較の場合もハウスキープ遺伝子単独のズレで結果が大きく変わってしまいやすいことからも全体の発現distributionなどを平均化するような形のノーマラズの手法の方が一般的だと思います。 結論から言うと、どちらも前提として同じ量の出発産物を比較したという趣旨のコントロールでしょうが、方法論が異なるためそれが成立するための前提条件は異なります。あとはそれをどう解釈するか自体ですがあえてマイナーな方法をとると後から文句がつく可能性もあるので、理由がないならよく使われている方法でやるのがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.8144-3 - 2019/08/09 (金) 12:00:21 - ちき 結局何が知りたいのかということにつきると思うのですが、普通に考えれば、 1. 単位細胞数あたり、あるいは単位細胞体積あたりのmRNAコピー数が知りたい。 2. 標準物と標的を同じ実験系で定量したほうがいいと思われるので、rRNA量あるいはリボソームタンパク質mRNA量を定量して、細胞数あるいは総細胞体積のインデックスとしたい。 ということだと思います。標準物として何がいいかは、それがいわゆるハウスキーピング遺伝子であるかどうかとか、どのRNAポリメラーゼで転写されているかではなく、細胞数あるいは総細胞体積のよいインデックスになっているかどうかでしょう。したがって、現在用いている標準物に疑義があるなら最初にやるべきはそれらの標準物(候補)と細胞数あるいは総細胞体積の標準曲線を自分で(自分の実験条件下で)作ることかと思います。よいインデックスになっているかどうかをここで質問されても、あなたの実験条件はだれも知りません。 もちろん疑義がなければ、多数派の論文に従えばいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.8144-2 - 2019/08/09 (金) 01:20:25 - おお 菌がなにか、その性質、菌のをどのように処理して経時的な観察をやっているかなど情報がないと具体的な答えが得られないのではないか？

RT-qPCRによる遺伝子発現解析における補正について 削除/引用 No.8144-1 - 2019/08/08 (木) 23:47:04 - dokuso 菌体を培地で培養し、経時的にサンプリングして、各サンプリングした菌体からtotal RNAを抽出し、サンプル間でのtotal RNA量を揃えた後にcDNA化して、ｑPCRによる遺伝子発現解析を試みています。経時的にサンプリングしている菌体数は菌体の16S rRNA遺伝子に特異的なプライマーを用いてqPCRにより菌数を算出しています。また、遺伝子発現解析にはハウスキーピング遺伝子である16S rRNAおよび30S ribosomal protein Sの発現量により補正することにしています。 　RT-ｑPCRを用いた菌体の遺伝子発現解析においては、ハウスキーピング遺伝子ではなく菌数により補正している論文も認めらました（私の解釈違いであれば、申し訳ございません）。一方で、ハウスキーピング遺伝子の発現量により補正することが一般的ではないかと解釈しております。 　ここで皆様のご教示頂きたいのですが、 １．ハウスキーピング遺伝子である16S rRNAで補正することは、菌数で補正することと同じと解釈して良いのでしょうか？異なっているとすれば、更に菌数で補正しなければならないのでしょうか？total RNA量をサンプル間で揃えているので、菌数での補正は不要ではないかと考えておりますが如何でしょうか？ ２．rRNAを転写するRNAポリメラーゼはmRNAのポリメラーゼとは異なるので、16S rRNAよりも30S ribosomal protein Sの方がよりハウスキーピング遺伝子として適していると考えますが如何でしょうか？ 大変基本的な質問となり、恐縮ではございますが、ご教示頂けますと有難いです。 どうぞよろしくお願い申し上げます。

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