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(無題) 削除/引用 No.8143-8 - 2019/08/11 (日) 23:15:56 - Hi-Cy おお様 ありがとうございました。 あくまで予測が載っていることもあるのですね。勉強になりました。 AP様 今回はUTRに着目しているため、全長が必要でした。 全長をクローニングしているベクターを発見したため、購入することにしました。 RACEも初めて知りましたが、今回はベクターを用いることにします。 大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.8143-7 - 2019/08/10 (土) 08:16:37 - AP 標的mRNAのサイズはいかほどでしょうか。 今ではかなり改良されてきていますが、逆転写酵素はそれほど伸長性が良くなく、鋳型の二次構造に弱い。oligo dTでプライミングして完全長、あるいほそれに近いレベルのcDNAを得るのは時として難しいことがあります。5’末端側が欠損するのは良くあること。足りないところをランダムプライマーでの逆転写したcDNAから5‘ RACEで取得して、つなぎ合わせるなんてこともよくやられます。最近じゃ、完全長cDNAを選択的に得る方法もいくつかあります。 あといくつか疑問点としては、 ・実験の目的として、UTRを含めた全長は必要なのか？ ・5’ UTRであるという情報の出元やそのエビデンスは？ 系統の違いによる配列の多型、標的組織の違いによるスプライスの多様性などがある可能性は排除できるのか？ どうしても完全な5’ UTRも欲しいというなら、先に述べたような方法で、配列情報に依存しないで自前で取得するのがいいかも。それは参考にした配列情報とは違うバリアントかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.8143-6 - 2019/08/10 (土) 00:39:33 - おお >個体臓器からmRNAを抽出してオリゴdTプライマー 特定の遺伝子だけに注目しているならGene specific プライマーでRTをやるのもてかもしれません。Poly A siteがわかっているなら。

(無題) 削除/引用 No.8143-5 - 2019/08/09 (金) 02:14:13 - おお >情報はとあるデータベースサイトに載っているものを鵜呑みにしていました。 詳細な記述があってESTからの推測だとか、そういうRNAが実際に取れているとか、５’側は完成してないとか情報があるものもあります。 NCBIのRefSeqのデーターをこないだ見たのですが、その対象は５’側は完成してないとかかれていました。またEnsemblではもっと長いものも見つかったりします。NCBIのデーターと５’や３’で結構違ったりEnsemblでバリエーションがおおかったりと結構戸惑います。 ＞実際はもっとmRNAが短く、プライマーが何にも結合していない 可能性だけで言うなら、スプライシングされてプライマーを設定したところが抜けて上流にエクソン１があるというケースも想定できますよね。

(無題) 削除/引用 No.8143-4 - 2019/08/09 (金) 01:15:55 - おお RACEという方法論があります。 https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-amplification-and-expression-profiling/cdna-protocol/5-race-system-for-rapid-amplification-of-cdna-ends.html また古典的な方法としてはPrimer extentionでどこで止まるか調べるというのがあります。RIでよくやられていた手法です。ある程度の量があればケミルミなどを使って代替えできるかもしれません。 RTがかからない理由として二次構造の可能性が挙げられますがそういった場合はRTを少し丁寧にやらないといけないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8143-3 - 2019/08/09 (金) 00:21:20 - Hi-Cy おお様 ご指摘のようなPCRをかけたことはありません。 サイトの情報によると、上流に80base存在するということになっていますが…？ 情報はとあるデータベースサイトに載っているものを鵜呑みにしていました。 もしかしたら、実際はもっとmRNAが短く、プライマーが何にも結合していないという可能性もありますね。 考えたことがありませんでした。 一般に、転写開始位置の特定、cDNA全長の解析はどのように行われるものなのでしょうか。 今パッと思いつくのが、cDNAに対してすでに上手くいっている片側のプライマーのみでPCRをかけて（かかるのか？）そのシーケンスを読む、というものです。 CDS自体が400bpほどしかないため、端までPCRがかかると考えているのですが…。

(無題) 削除/引用 No.8143-2 - 2019/08/08 (木) 22:55:48 - おお ＞一般的に、プライマーをUTRに設定したPCRはかかりにくいものなのでしょうか？ そんな事は今まで聞いたことがありません。ちなみにATGあたりから上流に向かってPCRしたらかかりますか？ ＞5'UTRの端から3'UTRの端まで 5'UTRの情報源は何でしょうか。場合によってはPredictionだったり、いろんな転写開始位置があり、その中で一番上流だけどかなり限られた発現だったりするかもしれません。目的の細胞や組織でご自身で転写開始位置を決めないと正確な情報が得られないかもしれません。

mRNA全長の増幅 削除/引用 No.8143-1 - 2019/08/08 (木) 22:42:57 - Hi-Cy はじめまして。 現在、mRNA-protein相互作用を解析したく、実験を行っております。 目的遺伝子のmRNAを用意すべく、個体臓器からmRNAを抽出してオリゴdTプライマーを用いてcDNA変換後、5'UTRの端から3'UTRの端までT7プロモーター付きの特異的プライマーでPCR増幅を試みました。 しかし、バンドが全く得られませんでした。 試しにゲノムDNAを鋳型として同じプライマーでPCRを行ったところ、予想される位置にバンドが見られました。 また、cDNAライブラリを用いてCDS領域でPCRをかけたところ、確かにバンドが得られました。 一般的に、プライマーをUTRに設定したPCRはかかりにくいものなのでしょうか？ 何かコツなどあるのでしょうか？ よろしくお願いします。

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