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2次抗体が変わると染まらない件について。 トピック削除
No.8142-TOPIC - 2019/08/08 (木) 17:17:11 - 暑いですね。
免疫組織染色で、同じ検体(連続切片)2枚を同じ1次抗体で反応させた後、1枚は2次抗体をHRP-conjugateのもの、もう一枚はFITC-conjugateのものでそれぞれ染めると前者では染まるであろう部分がきちんと染まるのですが、後者では全然染まりません。同じj1次抗体でも標識2次抗体が違うとそういうことありますか。どれでもそうということではなく、両方とも同じように染まる1次抗体の方が多いので、2次抗体が変ということではないようです。Negative controlも並行して染色してて、1次抗体、2次抗体の特異性は大丈夫と思います。酵素法の方はendoPODの不活性化とかもちゃんとやってます。

3重染色がしたくて今までやっていた酵素法から蛍光抗体法に切り替えようかと思いこの前の日曜日くらいからやってますがそんな感じです。1次抗体を変えたほうがいいならば、早めに買い替えてもいいのですが、結構高くて、今、他に買いたいものもが2つあるので、できるならば抗体は買いたくなくて、で、買ってからもし元の1次抗体OKだったらもったいないので一度みなさんに聞いてからと思い聞きました。
 
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(無題) 削除/引用
No.8142-5 - 2019/08/11 (日) 18:56:24 - あ
蛍光顕微鏡ではなく、共焦点顕微鏡を
使ってみると良いかも

(無題) 削除/引用
No.8142-4 - 2019/08/09 (金) 10:01:38 - 暑いですね
そうですね、今の蛍光抗体法はすごい綺麗ですが酵素抗体法のように増感のための工夫がないので感度的には劣りますね。そうやってみると他の抗体もそんな感じに見えます。
蛍光強度の強い色素に変えれば多少感度上がるかもしれないですね。ちょっと買います。
アンチフェードは一応入れていて、今の所は観察中にシグナルが弱くなるという感じはしません。

(無題) 削除/引用
No.8142-3 - 2019/08/08 (木) 22:23:47 - み
FITCは蛍光強度弱い部類に入るでしょう。
蛍光褪色防止剤で封入して観察されてますか?

(無題) 削除/引用
No.8142-2 - 2019/08/08 (木) 21:58:21 - おお
検出感度の違いかなぁと漠然と思う。

2次抗体が変わると染まらない件について。 削除/引用
No.8142-1 - 2019/08/08 (木) 17:17:11 - 暑いですね。
免疫組織染色で、同じ検体(連続切片)2枚を同じ1次抗体で反応させた後、1枚は2次抗体をHRP-conjugateのもの、もう一枚はFITC-conjugateのものでそれぞれ染めると前者では染まるであろう部分がきちんと染まるのですが、後者では全然染まりません。同じj1次抗体でも標識2次抗体が違うとそういうことありますか。どれでもそうということではなく、両方とも同じように染まる1次抗体の方が多いので、2次抗体が変ということではないようです。Negative controlも並行して染色してて、1次抗体、2次抗体の特異性は大丈夫と思います。酵素法の方はendoPODの不活性化とかもちゃんとやってます。

3重染色がしたくて今までやっていた酵素法から蛍光抗体法に切り替えようかと思いこの前の日曜日くらいからやってますがそんな感じです。1次抗体を変えたほうがいいならば、早めに買い替えてもいいのですが、結構高くて、今、他に買いたいものもが2つあるので、できるならば抗体は買いたくなくて、で、買ってからもし元の1次抗体OKだったらもったいないので一度みなさんに聞いてからと思い聞きました。

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