全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.8141-10 - 2019/08/14 (水) 06:18:10 - mon ＞ペプチドを長くしたら解決する問題とも思えない そうでもない。もちろん確実とはいえないですが。 ＞実際に抗原になるのは10-15 aaくらいに断片化されて提示されるペプチドだし、抗体と結合するエピトープの一単位も8 aa 前後じゃなかったっけ。 これは正しい。ですが、特異性のない領域＋特異性のある領域にまたがるようなエピトープを認識する抗体が出来る可能性もあり、これは目的タンパク特異的抗体である可能性が高い。

(無題) 削除/引用 No.8141-9 - 2019/08/10 (土) 12:51:33 - AP よくあること。 ペプチドを長くしたら解決する問題とも思えない（だってどんな長さのペプチドを使おうと、実際に抗原になるのは10-15 aaくらいに断片化されて提示されるペプチドだし、抗体と結合するエピトープの一単位も8 aa 前後じゃなかったっけ。 ペプチド抗原と違って、タンパク質の一部として存在するエピトープは、 非変性状態のとき認識されなかったり（立体構造の中で表層に暴露していないドメインに存在するなど）や逆に変性してしまうと認識されなかったり（アミノ酸の一次配列だけでなく、ある種の高次構造を認識している抗体など）があり得る。特に、生物標本の免疫染色する場合には前者のようになるのを避けるため、親水性領域やタンパク質の末端領域からエピトープを選ぶというのはよく言われること。とはいえ、抗体作成受託をしている業者の専門スタッフでもエピトープ選択でこれなら絶対大丈夫ってことはなく、抗体ができてみないとわからないもの。なので、普通は予算の許す限り複数のエピトープと複数ロットの免疫動物で免疫して良いのを選ぶ。 WBで出なかったということだけど、まずは抗体染色も試してみたら？あるいはNative PAGEでWBしてみるとか。非変性状態でもやっぱり陰性かどうか。もし非変性には反応するってのなら、膜状で変性を解いてやると（巻き戻し）反応するようになるかも？？？ WBのサンプルに十分に目的タンパク質が含まれていて、検出系も十分な感度をもっていることは保証されているのだろうか。単に検出感度限界以下だったからということは？　トランスフェクションなどで大量発現したサンプルなんかは用意できないだろうか？ 可能性としては、エピトープ部分がin vivoではプロセッシングや修飾のかかる部位にあたっていて、生物由来のタンパク質では抗体が反応しないということも、、

(無題) 削除/引用 No.8141-8 - 2019/08/09 (金) 21:35:16 - ど どのようにしてデザインしたのですか？ タンパクのN末端かC末端か、 親水性が高い領域かどうか、 デザインの専門家でさえ、100パーセント成功することは無いのだから 別に良くある話としか思えないけど。

(無題) 削除/引用 No.8141-7 - 2019/08/09 (金) 13:07:46 - 抗体はむずかしい http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo11.html

(無題) 削除/引用 No.8141-6 - 2019/08/09 (金) 10:29:15 - Ca おおさんとmonさんご意見をいただきましてありがとうございます。 ＞そのタンパク質のみに保存されているペプチド monさんの仰った通りそのタンパク質のみに保存されている「アミノ酸配列」です。 また、検出方法を明記しておらず申し訳ありません。 抗原ペプチドはELISAにて検出しました。目的タンパク質を検出する際はリコンビナントタンパク質50 ngを用いてW.B.によって行いました。 ELISAでは抗原ペプチドを認識しましたが、W.B.では検出できませんでした。 少なからず起こりうるケースなんですね。この対処方法は抗原ペプチドは14 AAなんですが、ペプチドのアミノ酸配列を長くして特異性を上げるくらいしかないんでしょうか。 後、やはり具体的な理由は見つけられないんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8141-5 - 2019/08/09 (金) 08:49:53 - おお ポリクロなのでそういうことがあるのかなとも思いますが、例えば末端を認識してしまう（末端に当たる部分がペプチド結合していたら認識にない）抗体がかなりドミナントにできてしまったりすれば蛋白を認識できないという事はありそうですけど。

(無題) 削除/引用 No.8141-4 - 2019/08/09 (金) 07:04:36 - mon ＞そのタンパク質のみに保存されているペプチド そのタンパク質のみに保存されている「アミノ酸配列」ですね。 抗体の結合をどのように検出している(WB,IP, IHC?)か記載がないのは困りますね。 同様の経験があります。抗原ペプチド(15アミノ酸）にはELISAでしっかり結合するデータが得られているのに、WBで目的タンパクが検出できないだけでなく組換えタンパクおよび内在タンパクのIP(ELISA)もできないというウサギpAb（抗血清）が有りました。 メーカーに聞いたところ、このようなケースは頻繁ではないが珍しいことではないそうで、具体的な対処法もないそうです。 もしかすると（特異性が上がるとされる）抗原ペプチドのアミノ酸配列を長め20−25残基にすると成功するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8141-3 - 2019/08/08 (木) 15:59:48 - おお ＞そのタンパク質のみに保存されているペプチド この言い回しなんかしっくりこない。

(無題) 削除/引用 No.8141-2 - 2019/08/08 (木) 15:58:39 - おお ＞次に目的のタンパク質を認識するか どうやって調べたのか？ELISAで認識するがWBではバンドが出ないという事なら認識するといえるし。リコンビナントで認識するがCell lysateでは難しいということもあるし、Cell lysateなら検出感度の問題かもしれない。

ペプチド抗体が目的のタンパク質を認識しない 削除/引用 No.8141-1 - 2019/08/08 (木) 14:23:31 - Ca タイトルの通りになります。 ある目的のタンパク質に対する抗体を作製するために、そのタンパク質のみに保存されているペプチドを基に抗原ペプチドを作製しました。 その抗原ペプチドをマウスに免疫することでポリクローナル抗体を作製しました。 この抗体は抗原ペプチドを認識したので、次に目的のタンパク質を認識するかを調べました。 しかしながら、作製した抗体はそのタンパク質を認識することができませんでした。 この理由として考えられることを教えていただければと思い投稿させていただきました。 よろしければお願いします。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---