BioTechnicalフォーラム [複数の膜タンパク質の発現システム]

複数の膜タンパク質の発現システム

No.8139-TOPIC - 2019/08/08 (木) 06:40:31 - IRESvs2A

複数の膜タンパク質の発現システムにつき相談させてください。

4つの膜タンパク質を同時に培養細胞に安定的に発現させたいのですが、その際のシステムとしてどの方法が相応しいか悩んでいます。

4つのうち3つは1型膜貫通タンパク質、残りの一つは2型です。
これらが膜型タンパク質である以上、2Aペプチドのシステムはワークしないと考えていますが、いかがでしょうか？

IRESにして、IRESの前後に遺伝子を導入し、選択マーカーはありませんが、フローサイトメトリーにて導入細胞をソートすることは可能です。その際、IRESの前後のタンパク質発現が確認できます。

やはりIRESの方がいいでしょうか。
それともbi-directionalな発現系の方がいいでしょうか？

4つの遺伝子を導入した経験はiPSC作製時にあるくらいで、その際には2Aペプチドシステムでした。

こういった方法があるよ、とご存知の方がいらっしゃいましたら、書き込みしていただけますと幸いです。
よろしくお願いいたします。
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全11件 ( 1 ～ 11 )　前 | 次　1/ 1. /1

(無題)

削除/引用

No.8139-11 - 2019/08/09 (金) 15:34:29 - asan

FACSが使えるなら4つぐらいならシーケンシャルにやるか、一度に4種類のウイルスを作製してコトラで発現させてから４つとも発現してる集団をソーティングして増やすのが確実かなあともいます。

ires, 2A,bidrectionalなどのファンシーな方法でもできるとは思いますが、作るのがめんどうだしコンストラクトのサイズも大きくなるしでことなるタンパク質の発現量をそれぞれコントロールするのが難ししで案外使い勝手は悪いともいます。

それなら、4種類ぐらいどかっと発現させてしまってソーティングまたはセレクションで全ての遺伝子に耐性な細胞集団を選ぶ方がいいです。Blasti. Puro, Hygro, Neo（Zeo)使えば4種類ならいけるし。

同じmRNAのコピー数とか調整が必要な実験なら一つのベクターに無理やり載せるとかは必要かもしれませんけどね。

(無題)

削除/引用

No.8139-10 - 2019/08/08 (木) 15:54:52 - おお

>やはりIRESの方がいいでしょうか。
>それともbi-directionalな発現系の方がいいでしょうか？

私が考えている事はすでに書きましたが、この選択肢ならbi-directionalや２つ発現ユニットがあるベクターを私なら使います。

(無題)

削除/引用

No.8139-9 - 2019/08/08 (木) 14:12:29 - mon

EMCV IRESを想定していると思いますので、他にも数多くありますが参考になる論文を紹介します。
“An Internal Ribosome Entry Site (IRES) Mutant Library for Tuning Expression Level of Multiple Genes in Mammalian Cells..” PLoS ONE 8 (12), 2013 : e82100. doi:10.1371/journal.pone.0082100.
IRES後のORFの翻訳開始部位付近の配列（特にATG）の影響について記載されています。
“Translational Efficiency of EMCV IRES in Bicistronic Vectors Is Dependent Upon IRES Sequence and Gene Location.” BioTechniques 41 (3), 2006: 283–4–286–288passim.
市販のベクターのIRESには5'/3'配列にバリエーションがありますので注意してください。5'側はCストレッチを含む長めの野生型配列が良いです。

> ダブルチェックをさせていただきたいのですが、この時cは発現量こそ低くなりはしますが、きちんと膜のトポロジーとして正しい向きを持って発現しますでしょうか？
問題ないと思いますが、遺伝子（配列）に依存するかもしれませんので注意してください。通常、II型膜タンパクのアミノ酸配列は、短めの親水性配列（細胞内ドメイン）ー長めの疎水性配列ー細胞外ドメインとなっていて、N末の多少の付加アミノ酸配列(peptide tag等）はトポロジーに影響しないようです。このためP2A付加も「おそらく」問題ないと考えています。なお、P2A切断(正確には切断ではないですが）も100％ではないので、未切断産物（おそらく急速に分解されるでしょうが）が細胞に悪さする可能性も否定できません。

(無題)

削除/引用

No.8139-8 - 2019/08/08 (木) 09:43:00 - おお

>トランスフェクションでも3日後にソーティングして、増やしたのち、2度目のソーティングすれば安定発現細胞が取れると考えています。

選択圧が働いてないのでそんなに積極的にIntegrationしないと思うので取れるかもしれませんが、発現はそんなに強くないかもしれません。それともそれでうまく行った経験とかうまく行った話を聞いたとか言うことでしょうか。

(無題)

削除/引用

No.8139-7 - 2019/08/08 (木) 09:05:46 - IRESvs2A

おお様、ありがとうございます。

＞ソートしたとしても、発現してはいるだろうけど、安定導入されたわけではないのでその後発現が弱くなって消失していくのでは？

仮にウイルスではなく、トランスフェクションでも3日後にソーティングして、増やしたのち、2度目のソーティングすれば安定発現細胞が取れると考えています。
おお先生がご提示していただいたように、難しいことを考えるのではなく、もう一つずつ入れていくのも手かもしれませんね...

(無題)

削除/引用

No.8139-6 - 2019/08/08 (木) 08:58:07 - おお

膜タンパクかどうかは思い出せないが、一ついれて安定株を作った上で更に導入してと、一つづつ入れて４個ぐらい入れていったという実験は見たことがあるけど。そうすると、それぞれの発現量が適切と思えるクローンを拾っていけるので（もちろん相互的な作用とか発現に影響することもあるので必ずしもうまくいくとは思えませんけど）。IRESは前の遺伝子の長さとかいろいろな要因があるけど、後ろは前より発現が弱くなる傾向にあると思います。

＞選択マーカーはありませんが、フローサイトメトリーにて導入細胞をソートすることは可能です。
ソートしたとしても、発現してはいるだろうけど、安定導入されたわけではないのでその後発現が弱くなって消失していくのでは？

(無題)

削除/引用

No.8139-5 - 2019/08/08 (木) 07:48:53 - IRESvs2A

mon様、ありがとうございます。

なるほど...1型膜貫通タンパクa-P2A-2型膜貫通タンパクbという順番なら大丈夫なのですね...目から鱗でした。ただ1型が1つで、2型が3つですので、mon様からご提案していただいた配列とIRES以下が異なっています...。

mon様からコメントいただき、2つのプラスミドを用いる方法を思いつきました。（以下にお示しします）

1型膜貫通タンパクa-P2A-2型膜貫通タンパクb__IRES＿2型膜貫通タンパクc

と

2型膜貫通タンパクd

です。
この場合、mon様のご指摘のIRES以下の遺伝子cの発現量が低下する可能性はありますが、2つならどうにかなりそうな気がしてきました。
ダブルチェックをさせていただきたいのですが、この時cは発現量こそ低くなりはしますが、きちんと膜のトポロジーとして正しい向きを持って発現しますでしょうか？

重ねて質問をしてしまい恐縮していますが、よろしくお願いいたします。

私も膜タンパク質の複数発現の論文をさらに検索してみます。

(無題)

削除/引用

No.8139-4 - 2019/08/08 (木) 07:35:56 - mon

1型膜貫通タンパクa-P2A-2型膜貫通タンパクb__IRES＿1型膜貫通タンパクc-P2A-2型膜貫通タンパクdの配列順で発現できると思います。
注意点は、IRES＿1型膜貫通タンパクcの接続部分の配列＊で、IRES以降の配列の翻訳効率が大きく低下する可能性があります。
＊について膜タンパク（シグナルペプチド）の場合に参考になる文献があったハズなので探してみます。

(無題)

削除/引用

No.8139-3 - 2019/08/08 (木) 07:31:18 - IRESvs2A

ありがとうございます。
はい、全ての膜タンパク質に対する抗体はあります。
その4つともフローサイトにルーチンに使っています。
今回は4つを293Tなどの細胞に入れて実験を行いたいと考えており、質問させていただきました。

(無題)

削除/引用

No.8139-2 - 2019/08/08 (木) 07:26:28 - An

質問に対する直接の回答ではないですが、、、

各々の膜タンパクの細胞外領域に対する抗体と、
細胞外を蛍光免疫染色する方法(できれば培養ディッシュ上で)
が無いと、何かの方法を試したとしても、ダメではないかな？

複数の膜タンパク質の発現システム

削除/引用

No.8139-1 - 2019/08/08 (木) 06:40:31 - IRESvs2A

全11件 ( 1 ～ 11 )　前 | 次　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

〔使い方〕

「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。