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(無題) 削除/引用 No.813-4 - 2012/08/05 (日) 10:28:05 - PAS A付加のPCR産物はligationされないのはその通りですね。 大変お恥ずかしい限りですが、invitrogen社web siteにて確かに「Pyrococcus species GB-D polymeraseとのmixである」との記述を発見致しました。情報収集が不十分であったと痛感しております。 迅速にご教授いただき誠に有り難うございました。

(無題) 削除/引用 No.813-3 - 2012/08/05 (日) 10:15:49 - AP Platinum Taq DNA polymerase High FidelityはTaq polymeraseと校正活性のあるPyrococcusのpolymeraseのmixのようですので、平滑末端のPCR産物ができてもなんら不思議ではないですけれど。おそらく一塩基Aの3'突出末端と平滑末端の混合物になっていると思います。たしかTAKARAのExTaqがそうでしたね。RocheのHigh Fedelityもそうだったかな。 また一塩基Aの3'突出末端が両末端あるいは片側末端に生じたPCR産物は環状化ligationが起こりませんので、一塩基挿入のクローンは生じる訳ありません。 両末端平滑の産物のみがコロニーを生じるはずです。

TaqのTdT活性 削除/引用 No.813-1 - 2012/08/05 (日) 05:28:00 - PAS site-directed mutagenesisを行っております。私の単純な勘違いにより、Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity（Invitrogen）を使って変異導入してしまいました。ところが一見充分な数の大腸菌コロニーが取得でき、シークエンスを確認したところTdT活性によるであろう余分な一塩基付加も見られませんでした。当該Taqのマニュアルには、通常のTaqと同じTdT活性（A塩基）を有するとしか書かれていないません。何故このようにA付加のないクローンが得られたのでしょうか？ というのも、まだ他の変異導入に取り組んでおり、上記の勘違いに気付いた時点でAccuprime Pfx DNA polymeraseに変えたのですが、とたんにPCRがかからなくなってしましました。現在条件検討を行い改善を図っているのですが、いっそのことTaq HiFiでPCRを行い、A付加のないクローン取得を狙った方が賢明なのかと迷っています。海外に移って来たために使い慣れた酵素が使えず、予期せぬところで足踏みしてしまっている次第です。

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