M様、返信が遅れてまして、申し訳ありませんでした。
実はM様からコメントいただき、もう少し検討の余地がありそうだと思い、いくつか条件を変えて染色してみました。
巨核球はDMSという特殊な膜を持っているので、界面活性剤の濃度や抗体の反応時間を検討してみました。
オーバーナイト染色でひょっとするとうまくいくかと期待していましたが、いずれの変えた条件でも全く染まりませんでした。（たった今データがでました）
> 固定及び膜透過処理は、Bリンパ球と同じで良い事を、何らかの形で確認してますか？
いえ、確認しておりません。
M様のおっしゃる通りです。ポジコンでうまくいっているので、他の細胞でもうまくいくという前提がまず無かったのですね。
CD41染色は固定して膜透過後に行っています。
この方法では確かに細胞内CD41も染まる条件になります。
CD41は綺麗に染まっていますので固定の影響や膜透過の影響は、する前とで比較はしていませんが、大丈夫なのかなと思っています。mTmG;Pf4Cre miceではCD41+がGFP+になりますので、固定してもCD41抗体の特異性は変わらないと考えています。
> 巨核球はちょっと特殊なので、B細胞と同じで良いかどうか、言い切れる自信が私にはありません。
私は短絡的すぎたなと今思っています。M様のおっしゃられる通りです。
何がうまくいかない理由なのでしょうか...固定、透過処理、抗体反応、このいずれかだと思うのですが...
ploidy解析時は、生細胞を染めていました。
具体的には新鮮な骨髄細胞をCD41染色後、膜透過型のhoechst33342で染めて、解析をしていました。
シグナル解析は一先ずフローで行うことは難しそうですね。
ただ、M様からのコメントをいただかなければ、もっと多くの時間を浪費していたと思います。
本当に重ねてお礼申し上げます。また自分の短絡的な考えを見直すいい機会となりました。
胎児期肝臓細胞でのシグナル解析（ウエスタンブロット）でレビュアーの質問に応えられないかこれから始めたいと思います。
一つそれに関連してお聞きしてもよろしいでしょうか？
私は巨核球の単離を以下のプロトコルを参考にして行っています。
Methods Mol Biol. 2012;788:259-73. doi: 10.1007/978-1-61779-307-3_18.
Purification of native bone marrow megakaryocytes for studies of gene expression.
ただ、BSA密度勾配法で得られる、純度としては良くて5割、うまく行かない時には1割にも満たない場合があります。M様はfetal liver megakaryocytesの単離はどのように行っていますか？もしよろしければ、参考文献をお示しいただけると大変助かります。
上記の方法では
・底に沈む巨核球分画の純度が良くて5割ほど
・底に沈まなかった上層に他の細胞と共存する巨核球が思いの外多いこと
などがあり、このプロトコルが果たして最前なのか疑念を抱きました。
M様のプロトコルではこれらはどういった印象でしょうか？
重ねて質問してしまい、大変恐縮ですが、どうかよろしくお願いいたします。 |
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