> その後、10％ホルマリンで室温10分、続けて0.1％Triton X−100で室温30分後、600g、5分で最初の遠心とします。この際、1.5mlチューブの壁面に細胞が付着しており、チューブの底面に綺麗にペレットが作られていません。この上清を慎重に捨て、そこへ0.5％BSA 10 mM EDTA in PBS 1 mlを加え細胞を洗浄し、600g、5分で2度目の遠心とします。これを再度繰り返し、3度遠心するともはや細胞の痕跡すら認めずです。
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> 目的の細胞は骨髄中の幹細胞ですので、これだけロスが多いと実験することができません。
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> そこで質問させていただきたいのですが、
> 1. 固定さえしてしまえば、細胞のロスを防ぐためもっと大きなgで遠心しても良いのでしょうか？
生細胞でも少々gをかけても死にませんよ。レトロウイルスの感染なんて>1000 x gで二時間ぐらい遠心しても平気ですから。固定さいぼうなら面倒くさい時は1500 x g 3minなんかでやってます。
> 2. BSAの濃度はもっと高めた方が細胞は落ちやすいでしょうか？
その細胞を加える前にチューブにBSA溶液を入れてしばらく室温に置いといてから使ったらいいんです。それかシリコナイズしてもいいですが面倒です。ペレットができないのは壁に細胞がくっつくからです。ChIPなんかするときでもよくあることです。
これでダメなら、swing bucketでやればペレットができないことはないですが、round-bottomのチューブではペレットが広がるので、嫌がる人はいます。
> 3. 0.1％Triton X−100が高過ぎるから細胞がロスするという可能性はありますでしょうか？
その辺はどうなんでしょうね。わかりません。 |
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