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(無題) 削除/引用 No.810-20 - 2012/08/07 (火) 10:36:18 - 投稿者 (゜Д゜さん ありがとうございます。 大変参考にさせていただきました。 >実際SDSで可溶化したサンプルでIPするときTritonX入りbufferで10-20倍希釈する tritonで「中和」してsdsが抗原抗体反応に影響するのを防ぐということですね？ >最終濃度はSDSよりも少なくとも一桁は低くないと影響出るよ。 sdsの<10 %程度の濃度（sds 2%なら、triton <0.2 %）ということですね。 >クチクラとかそっち系の成分 >脂肪酸関係 >界面活性剤とかと合わなそうな気が 成虫の体表にはたくさんある（性フェロモンなど）のは知ってますが、 すみません、幼虫まではわかりません…。実験のお手伝いが仕事ですので不勉強です…。 ですが、脂肪といえば、 幼虫を解剖しているとき脂肪体を破ってしまうと バッファー水面に小さな油滴を作るくらいの脂肪が出てきます。 そういった意味では、解剖後しっかりwashしないと sdsをジャマする要因になるのかもしれません。 >SDS sample bufferで直接可溶化するのがいいとおもう。 おっしゃる通りですね。 SDS buffer中で可溶化・定量した後、 2x SDS sample buffer（還元剤・BPBあり）で希釈する、 という方法をとってみようと思います。 >古すぎるSDSはやばいよ。かなり酸性化するよアレ。 古いsds sample bufferだと真っ黄色になったりしますよね。 さすがに使ったことはありませんが、泳動に使ったらどうなるんでしょう。 なんで酸性化するんでしょうね。 sdsが分解すると硫酸ナトリウムと脂肪アルコールが生じるそうですがhttp://bit.ly/NYF8Wd、 どちらも酸性ではないですよね。

(無題) 削除/引用 No.810-19 - 2012/08/04 (土) 04:23:21 - (゜Д゜ 8が指摘しているように、SDSと非イオン性界面活性剤（Triton XとかNP40とか）はお互いに相手の働きを打ち消すらしいんだ。実際SDSで可溶化したサンプルでIPするときTritonX入りbufferで10-20倍希釈するとか、うちらよくやるし。で、質問の件だが、SDS>>Triton Xならいいのかもしれないけど、SDS>Troton X　とかSDS=Triton XとかSDS<Triton XとかだとSDSの本来の変性可溶化能が妨げられるから、その状態でそれを無理に泳動したらまあデータは｀＊＋！！？？＆！？？だな。810-3にでてる実験手順をから考えると最終のSDS-PAGE用sampleはSDS=2%, Triton X=1%ということになるわけだが、もしこれで計算正しいなら、TrotonX濃すぎ。やっぱ最終濃度はSDSよりも少なくとも一桁は低くないと影響出るよ。 12が言うようにTritinX 可溶化物をTCA沈殿というのも対応策として確かに有りだが、界面活性剤存在下でかつ蛋白質濃度が低いと結構沈殿できにくいことあるからここでの蛋白質のloss、とくに塩基性蛋白質のlossがちょっと心配だな。 TCA沈殿後はアセトンとかエタノールで1~2回洗浄して酸を除いてる。Trisとかで中和しようとすると塩を持ち込むことになり、サンプルの塩濃度が増えて泳動パタンの横への拡散などを助長することがあるから。 長いDNAの混入もしばしば泳動パタンを乱す原因になるけど、実験手順見るとその可能性はなさそうだね。線忠だとか虫関係だとクチクラとかそっち系の成分とかいっぱいあるとおもうんだがそう言うのはなんか影響とかないかな。あれとかって水はじくし脂肪っていうか脂肪酸関係だろ、詳しい事知らないけど、だろ。そういうのが大量にあるとイメージ的に界面活性剤とかと合わなそうな気がするんだが。 (゜Д゜もSDS　sample bufferで直接可溶化するのがいいとおもう。ていうかTritonXで可溶化する具体的な理由がなくて、単に蛋白質取ってウェスタンしたいということなら、ふつうそうするとおもう。あと蛋白質定量だがSDSあるとブラッドフォールドは使えないからBCA法とかでやることになる。ただBCA法は還元剤が×だから定量が済んでから、bME入れる。当たり前だが、BPBは青いからこれも定量が済んでから入れる。 16が書いてることに関連して思い出したんだが、古すぎるSDSはやばいよ。かなり酸性化するよアレ。当方、過去にイタい経験有り。（まあ購入後１年以内くらいなら別に問題ないと思うけど。）

(無題) 削除/引用 No.810-18 - 2012/08/03 (金) 12:53:00 - 投稿者 ccさん 私は2年前に開封したnkのラウリル硫酸（生化学研究用特製試薬）です。 （信憑性は別として）sdsは1年経てば古いという方もいらっしゃるそうですからhttp://bit.ly/RkpFfE、 もしsdsが原因だとしたら、nkでも新しい方がいいのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.810-16 - 2012/08/03 (金) 12:40:13 - cc マーカーバンドは比較的ましでしたけど。流す時間が長いとちょっとずつ曲がってくる印象です。 後は、バンドの真ん中あたりが薄いですね。 私のところの場合は、ｗｋのドデシル硫酸（分子生物用）から、nkのラウリル硫酸（生化学研究用特製試薬）に変更しました。 ちなみに、ＳＤＳだけ変えて両者を比較したところ前者だけが曲がりましたｗ ｗｋ社のものは、古くもなく、またロットを変えても曲がったので、 いまいち、原因は分かりませんが、他の試薬との相性かなとか、勝手に思っています。

(無題) 削除/引用 No.810-15 - 2012/08/03 (金) 11:46:47 - 投稿者 朝一番さん >ＴＣＡなど酸沈殿による前処理を勧めます。 サンプルバッファーを入れたあとは濃縮できないようなので、 やるなら希釈前ですよね。

(無題) 削除/引用 No.810-14 - 2012/08/03 (金) 11:38:48 - 投稿者 Tritonさん >カップコーンタイプがもしあれば可能です。 チューブの外からsonicationできるタイプもあるのですね。 サンプルチューブを水に浸けて下から超音波を当てると。http://bit.ly/MmKFpT >総組織からの抽出は1% SDS/1mM HClでやってます。 はじめからSDSを抽出用界面活性剤として使ってしまうのはいい手ですね。

(無題) 削除/引用 No.810-13 - 2012/08/03 (金) 06:53:10 - 朝一番 Ｔｒｉｔｏｎや一緒に抽出された脂質はＳＤＳの有効濃度を低下させます。Tritonさんが提案する抽出液のＴｒｉｔｏｎ濃度を下げる方法は有効です。濃度低下による抽出効率の低下を気にするなら、単にＳＤＳサンプルバッファに投入する試料の量をへらす（１／１０程度？）のも簡単にできる対応です。タンパク量５０μｇ確保が必須なら、ＴＣＡなど酸沈殿による前処理を勧めます。

(無題) 削除/引用 No.810-12 - 2012/08/03 (金) 00:17:16 - Triton sonicationについてですが、tipタイプではもちろん無理ですが、カップコーンタイプがもしあれば可能です。めがねクリーナーのようなバスタイプでも、うまくやれば効きます。ただ、これの目的はDNAをつぶすだけなので、先の細いチップで吸い出しでも多少は効果あるかもしれません。IPしないのなら、総組織からの抽出は1% SDS/1mM HClでやってます。酸性のほうがDNAが切れやすいので。ポリペプチドにはほぼ影響しませんし、サンプルバッファを加えればすぐに中性になります。

(無題) 削除/引用 No.810-11 - 2012/08/02 (木) 20:01:50 - 投稿者 ccさん ありがとうございます。 >私の場合はやってるうちに、マーカーのバンドも若干曲がるようになりましたが……。 私もそうです！ はじめの2,3回は比較的きれいなバンドが出せたのですが、 徐々に曲がってきている印象があります。 まだマーカーは無事ですが、いずれ曲がってくるのでしょうか。 >サンプルバッファーやサンプル、 >泳動バッファーを作り直す、 >ゲルも新しい試薬で作り直すなどしましたが、 1ヶ月前の私ですw >ＳＤＳを別のメーカーのものに変更したところ、改善されました。 上記の状況がよく似ているので、私も他のメーカーのものを試してみます。 もし差し支えなければですが、改善が見られたメーカーを教えていただけませんでしょうか？ちなみに私はnkライのものを使っています。

(無題) 削除/引用 No.810-10 - 2012/08/02 (木) 19:54:31 - 投稿者 Tritonさん ありがとうございます。 >１：１位だと、ゆがんだり太くなったりします。 >TX濃度はSDSの1/5くらいが目安です。 とても参考になります。 希釈後の泳動サンプルは、 ・2 % SDS ・1 % Triton X-100 なので、まだtritonが濃いのかも知れません。 遠心を長くしても改善が見られない場合、 こちらを試して見たいと思います。 ホモジェナイズバッファーを0.8 % tritonにして、 終濃度 0.4 %になるのがベストでしょうか。 > sonicateしてDNAをつぶしてアプライ 不勉強で申し訳ないのですが、 サンプルボリュームが少なくても（100-200 ulでも）、 sonication可能なのでしょうか？ …というかこれくらいは自分で調べるべきですよね。調べてみます。 ちなみにIPはしない実験系です。

(無題) 削除/引用 No.810-9 - 2012/08/02 (木) 18:02:24 - cc Tritonは使っていませんが、同じようにバンドがＭ字状にゆがんだことがあります。 私の場合はやってるうちに、マーカーのバンドも若干曲がるようになりましたが……。 サンプルバッファーやサンプル、泳動バッファーを作り直す、ゲルも新しい試薬で作り直すなどしましたが、改善されなかったのですが、ＳＤＳを別のメーカーのものに変更したところ、改善されました。（もともとラボに二社のメーカーのＳＤＳが置いてあり、以前はＡ社のものを使っていて正常、Ｂ社に変えた後にこのような現象が見られ、Ａ社に戻した） 試薬グレードは同じだったのですが。 質問者さまの状況とは違うかもしれませんが、参考になればと思います。

(無題) 削除/引用 No.810-8 - 2012/08/02 (木) 13:22:21 - Triton タンパク量が多すぎる可能性もありますが、それでなければ、最初の御質問の通り、Tritonの濃度がSDSに比べて十分に低くないのが原因でしょう。大体、１：１位だと、ゆがんだり太くなったりします。TX濃度はSDSの1/5くらいが目安です。Triton濃度を半分にして抽出してもたいして効率は変わらないと思うので、それで改善されるかを見られればいかがでしょうか？電気泳動のSDS濃度を倍にしても良いですが、あまりSDS濃度を上げると分離が悪くなります。 　ただこういう場合、SDSで個体を可溶化してsonicateしてDNAをつぶしてアプライするわけにはいかないのですか？IPされるのでなければ。

(無題) 削除/引用 No.810-7 - 2012/08/02 (木) 08:51:52 - 投稿者 qqさん >5mg/mlのタンパク量を想定しています。 現条件では、約4 mg/ml（希釈前）になります。 参考論文の幼虫のクルードサンプルの泳動と比べて かなり濃い方なのではと思いますが、 sds-page一般ではごく普通の濃度なのかも知れません。 >遠心の時間 ->10分とか20分とか >冷却遠心 3分だからと横着して冷却していませんでした…。改善します。 あと遠心時間も10-20に伸ばしてみます。 >ホモジナイズのところで遠心前に希釈 >ただ、タンパク定量で悩むことになるかもしれませんね。 そうなんです。変性剤入れてからだと定量できないですよね。 BCAもBradfordも。 そんな基本的なことに気づかず 何度か定量を試みてしまったことがあります。

(無題) 削除/引用 No.810-6 - 2012/08/02 (木) 07:37:23 - qq ＞うーん、濃いのが原因だとしたら希釈して、 ホモジナイズのところで遠心前に希釈でしょう。荒っぽすぎる概算ですが、組織100mgに対して、2ml程度の抽出液が必要なのではないでしょうか？5mg/mlのタンパク量を想定しています。 遠心の時間が3minは、短すぎる気がします。10分とか20分とかではあにでしょうか？ それとも、冷却遠心ではないのでしょうか？ 冷却できないのであれば、むしろ、ｔｒｉｔｏｎの抽出ではなく、直接、SDSサンプルバッファを使う方がよいのではないでしょうか。 ただ、タンパク定量で悩むことになるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.810-5 - 2012/08/02 (木) 05:37:45 - 投稿者 Qさん ありがとうございます。 >アプライが雑とか、アプライする前にウェル内をきちんと洗うとか。 200のピペットマンでウェルのゴミをキレイにしたあと、 サンプルが巻き上がらないようにゆっくりアプライしています。 前職では普通のバンドが出せていました。 濃さが均一で、直線で、両縁の丸っこいバンドです。 ただしwesternではなく銀染ですが。 blottingに原因があるのもありえなくはないですが、 バンド１つ１つに個別に症状があるの（ブロッティングが）と、 以前と異なり今はクルードを使ってるので、 泳動サンプルのバッファー組成のせいかなー？ と疑っています。 他にも 泳動槽のメーカーが違う、 試薬のメーカーが違うなど細かいところはありますが、 そちらは問題ないかなと思っております。 別件ですが、 JflyとFlyBaseに質問投稿するには特別な登録が必要なようで、 お手伝いさんのような私にはハードルが高くてすこし悩んでいます。

(無題) 削除/引用 No.810-4 - 2012/08/02 (木) 02:06:00 - Q ゲルが変とか、アプライが雑とか、アプライする前にウェル内をきちんと洗うとか。

(無題) 削除/引用 No.810-3 - 2012/08/01 (水) 21:37:19 - 投稿者 qqさん 早速のご助言ありがとうございます。 >作り方を重量・容量込みで正確に教えていただけますか？ まだ条件検討中ですが、 クルードサンプルの作り方は、 ↓3齢幼虫のbody wall 　- wandering stage 　- 解剖で内臓・中枢神経系を除去 ↓body wallをホモジェナイズ 　- 36枚 　- 135 ul バッファー 　　　50 mM TrisHCl ph 7.4 　　　150 mM NaCl 　　　2 % Triton X-100 　- すりガラス使用 ↓遠心、10,000 rpm, 3 min ↓定量 　- BCA assay 　- 上清を使用 ↓2x sds bufferで希釈 　- 約 2 ug/ulになります 　- boil 100℃, 5 min ↓ 泳動 　- 25 ul（50 ug）ロード 　- 10 % gel (29:1) 　- 20-25 mA c.c. です。 >何となく、濃すぎんじゃない？と思わないではないのですが、 かなり濃いと思います。 割りとまだ始めたばかりなのですが 最終的なシグナル強度が弱かったので濃くしていました。 うーん、濃いのが原因だとしたら希釈して、 泳動以降の抗体・発光の条件検討をしたほうが吉でしょうか？ >flybaseやjfly？などのハエのHPに聞いた方が早いかも。 そうしてみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.810-2 - 2012/08/01 (水) 20:58:35 - qq 何となく、濃すぎんじゃない？と思わないではないのですが、 ＞幼虫のクルードサンプル の作り方を重量・容量込みで正確に教えていただけますか？ flybaseやjfly？などのハエのHPに聞いた方が早いかも。

sds-pageのバンド、Triton X-100でゆがむ？ 削除/引用 No.810-1 - 2012/08/01 (水) 19:43:07 - bam margera Drosophilaのwesternをしています。 幼虫のクルードサンプル（バッファーにTriton X-100含む）をsds-pageで泳動しているのですが、 figureに載せられるようなきれいなバンドが出せず、困っています。 症状 ・バンドがそれぞれM字状に波打つ ・シグナル強度にムラがある（1本のバンドに濃い部分と薄い部分がある） ・バンドが左右ににじんでとなりのバンドとの境界が曖昧になる クルードの固形が入らないように、遠心して上清のみアプライしています。 試薬は何度も作り直しましたが、改善しません。 マーカーバンドの形状は正常なので、 泳動サンプルを疑っていたところ、 他の質問サイトで「Triton X-100を含むとバンドがゆがむ」http://bit.ly/OCeEcX という回答を見かけた。 同質問の他の回答にもありますように、 界面活性剤ならSDSが高濃度に含まれているので tritonが原因とは考えにくい気もするのですが、 実際にtritonが原因でバンドがゆがんだ経験をお持ちの方いらっしゃいませんか？ また、カラムでバッファー置換や、限外ろ過で解決したという方いませんでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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