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ありがとうございます 削除/引用 No.8093-9 - 2019/07/26 (金) 09:14:57 - 実験初心者 理解不足な質問にお答えいただき、ありがとうございます。 頭が少し整理できました。頑張ってみます。

(無題) 削除/引用 No.8093-8 - 2019/07/23 (火) 17:10:22 - 774 "作成したプラスミド"の重量と分子量がわかればモル数が計算できる。 モル数がわかれば分子数（＝コピー数）が計算できる。 ちょっと混乱してるようですが、作成したプラスミドの分子数だけを数えましょう。 落ち着いて考えると難しいことではないはずです。

(無題) 削除/引用 No.8093-7 - 2019/07/23 (火) 14:27:47 - p 具体例を挙げて、コピー数の算出方法を教えていただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.8093-4 - 2019/07/22 (月) 19:15:59 - AP >二重鎖DNAプロダクトの長さは3855bpであるとPubmedに記載があるため、 それは自分でPCRで増やしたサイズと一致しているのか？ PCRでコピー数の標準として使うなら、完全長でなくてもいいはずだし（PCRの標的領域、　両プライマーに挟まれる配列、を含むだけでよい）。 実際のPCR産物の鎖長は実験デザイン、プライマーのデザインを詳しく説明でもせぬ限り、設計した本人じゃないとわからないのだが。 それと、プラスミドにクローニングしたDNAを使用するなら、インサート+ベクターの分子量で考えなければならないし、定量だってプラスミドとしてやっているんだろう？　だったらインサートの鎖長がいくつで分子量がいくつで、なんてことで計算していくのはトンチンカン。

回答ありがとうございます。 削除/引用 No.8093-3 - 2019/07/22 (月) 18:03:49 - 実験初心者 ご指摘ありがとうございます。 物分かりが悪くて申し訳ないのですが、プラスミドの濃度、分子量、分子数が相手にするというのは、具体的にどうすればよいのでしょうか？ 例えば、GAPDHのプラスミドDNAを作った場合 二重鎖DNAプロダクトの長さは3855bpであるとPubmedに記載があるため、 分子量の計算では 　3855(bp)×330 daltons×2 nt/bp=2544300 daltons(g/mole) となり 分子量からコピー数への変換では 2544300 g/mole÷アボガドロ定数(6.023×10^23molecules/mole)=4.2264119...×10^-18 g/moleclue から 1pgのプラスミドで約23.66万コピーに相当ということでよいのでしょうか？ その場合 吸光度で測定したプラスミドDNAの濃度が仮に10ng/μLであった場合に定量PCRで1μL使用した場合は 約2366万コピーとして、データを算出していけばよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8093-2 - 2019/07/22 (月) 17:12:28 - AP プラスミドを標準分子としてつかうんだろ？ だったらPCR産物の分子量が、、、プライマーが、、、なんて全くの的外れです。標準として使うプラスミドの濃度、分子量、分子数が相手です。 だって、吸光度/濃度測定するのはプラスミドに対してだし、実際に使うときもプラスミドとして使うんだろ。なんでPCR産物の分子量やらが出てくるのか、、、、 なにをやろうとしているのか、何をやっているのか、よく考え理解すべきですね。 関係ないけど、分子量をプライマー込みにするか（PCR産物を標準とする場合はそうすべきですが）、プライマーは勘定に入れないかなんて、おそらく微々たる誤差の範囲です。

定量PCRにおいてスタンダードのコピー数の求め方について 削除/引用 No.8093-1 - 2019/07/22 (月) 16:02:44 - 実験初心者 検量線を引いてサンプルの発現量を比較したいと思っています。 TA cloningにより、目的となる遺伝子のプラスミドDNAを作りました。 このプラスミドDNAのコピー数を算出したいのですが、 コピー数（コピー/μｌ）＝A/B×6.02×10^14 　 A＝吸光度から求めた核酸の濃度（ng/μl） B＝核酸の分子量 （分子量はDNA 1bp＝660、RNA 1b＝330（近似値）を用いるよよいとネットで記載がありました。 ここでの核酸の分子量はプライマー設計の際に、設定した産物されるbpから計算するのでしょうか？ 目的の遺伝子をPubmedで調べた際に、遺伝子のサイズとして記載されているbpで計算するのでしょうか？ 基本的なことがわかっておらず、申し訳ないですが、誰かご教示いただけると幸甚です。

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