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(無題) 削除/引用 No.8086-7 - 2019/07/18 (木) 16:05:15 - toto キアゲンでないで参考にならないかもしれませんが、うちでは10年以上前に大量に買い込んでだGLサイエンスのMonoFasをずっと使ってきて、２年前くらいになくなってきたので、100個で38ドルというEnzymaxのDNA Mini spin column に惹かれて買い込んでバッファーは自作して毎日ゲル抽出してますが、トラブルは記憶にないです。10年前のでも問題なく使えます。ゲルを溶かすバッファーはguanidine thiocyanateか、塩酸グアニジンなので、簡単に作れます。

(無題) 削除/引用 No.8086-6 - 2019/07/18 (木) 15:57:47 - SYBR master カラム以外は自作してます。 過去にあった経験では、 1) 長期間使用していなかったため、Washing bufferのEtOHが飛んで濃度が変わっていたが、使用者が初心者でそれに気がつかなくて激減した。これ以降washing bufferのEtOHは用時調製で対応。 2) Washing bufferに　EtOHを入れ忘れた。使用者が初心者でそれに気がつかなくて全く回収できていなかった。 EtOHに関しては他の精製用kitでも用時調製を勧めているものもあります。

(無題) 削除/引用 No.8086-5 - 2019/07/18 (木) 14:24:56 - GEX レスありがとうございます。 意外と皆さん劇的な効率低下は経験されてないんですね…。他のラボメンバーも同じことを言っているので、手技によるものではないと思うのですが…。 溶出はもちろんElution Bufferです。 カラムは、キットによってはミニプレップキットと同一商品を使う形なんですが、ミニプレの方は顕著な効率低下はないんですよねぇ…。 毎度、ものの数ヶ月で、ゲル抽出後50 ng/uLぐらい得られるもの（実際当初得られていたもの）が、1 ng/uL程度下手したらマイナスの濃度をたたき出すという体たらくです。 それでもライゲーション〜形質転換はこれまで概ね上手くいっていたのであまり気にしていなかったのですが、最近突然いきなりクローニングがほとんど上手くいかなくなり、色々考えてもゲル抽出の効率が最も怪しいと考えているのですが…（仮にクローニング失敗の原因がこれじゃなくても、いずれにせよ劇的な効率低下は常に経験しているので、その原因を質問させていただいた次第です）。 保存環境に何か問題があるのかもしれませんね。ちょっと注意深く色々改めてみてみようと思います。 何かご意見ある方いらっしゃいましたら、引き続きご助言いただけたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.8086-4 - 2019/07/18 (木) 10:50:51 - bluehornet monさんのご指摘の通りシリカ膜の劣化だと思います。 当方でも、化石的なカラムを用いたときに収量の激減を経験しました。 monさんが「0.1M HClで洗浄」を提案してくださっていますが、僕は以下のリンクに記載のある方法（「Recycling Qiagen Columns」の項目）でカラムの再生を行って使用した経験がありますよ。 ttps://openwetware.org/wiki/Qiagen_Buffers 僕はゲル抽のキットは用いてませんが「PCR purification Kit」付属のPBは20年物を用いています。全く問題なく抽出はできています。

(無題) 削除/引用 No.8086-3 - 2019/07/18 (木) 07:10:56 - mon Elution BufferはDDWでしょうか、空気中のCO2で酸性化すると収率が激減します。kitに付属の5−10mM Tris-HCl(pH8-8.5)をお使いなら問題ないと思います。 GuanidineベースのGel溶解BufferやWash bufferは劣化しないと思います。 残るは、シリカ膜の劣化でしょうか?? カラム再生に使えるという0.1M HClで洗浄すると、もしかしたら効果あるかも。

(無題) 削除/引用 No.8086-2 - 2019/07/18 (木) 06:07:30 - 遠さく爆推し そこまで劣化するでしょうか？ 私は当初キアゲンを買っていましたが、安いとの理由でジェンスクリプトのものに変えました。 1年黄色いゲル溶解バッファーは数年以上前のものでも普通にワークしています。 経年劣化する環境に違いがあるのでしょうかね。

アガロースゲル抽出キットの効率低下 削除/引用 No.8086-1 - 2019/07/18 (木) 04:16:13 - GEX QiagenのQIAquick Gelを筆頭に各社Gel Extraction bufferでゲルを溶解→カラム→wash→抽出…系のキットを出していますが、これまで複数社の製品を試しましたが、どうも購入直後は抽出効率がすこぶる良いのに、どれもある程度経つと絶望的に回収率が悪くなる印象があります。 Exraction bufferのpHが一番注意点として挙げられそうですが、色的には問題ないし、気まぐれにpHを調整してみても、大した変化はなかったように記憶しています。 具体的にありがちかつ見落としがちな落とし穴ポイントって、実際何かありますでしょうか？ （適当なでっちあげの例：washバッファーのエタノールが、実は飛びやすくてダメになりがち、など） 気をつけているTipsなどありましたら、ご教示いただけるとありがたく存じます。

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