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(無題) 削除/引用 No.8067-5 - 2019/07/11 (木) 07:05:57 - さかな初心者 ＞おお様 アドバイスありがとうございます。 おっしゃる通りで、他の実験での4％PFAのみでの固定後のサンプルはその後に色々と染色などした後にも全く問題なくPCRがかかります。私もグルタルアルデヒドが悪さをしているのではないかと考えております。 一度ご指摘の1.5％PFAからスタートして混合溶液に変更するのを試してみたいと思います。 今のジェノタイピングのPCR産物は約300bpsです。そこから制限酵素処理をしていまして、50と250bpsに分かれるようなものを使っております。少し小さめのProductのものも検討してみます。 参考にさせて頂きます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8067-4 - 2019/07/11 (木) 06:21:21 - おお 固定後のサンプルからのDNA抽出はいろいろ論文が出回っていると思います。かかりが悪くなるのはまあ仕方がないかなとはおもいますが実験で必要ならなんとかクリアーしたいのもわかります。 2％グルタルアルデヒド＋1.5％PFAってかなり強い固定かとおもいます。とくにグルタルアルデヒドは非常に強い（なんの尺度で強いというわけでもないので印象だけですが）のではと。 例えば1.5％PFA固定後切り分けて、2％グルタルアルデヒド＋1.5％PFAに置換するとかできないでしょうか。 あとプライマーは複数試してみるのも手かと思います。なるべく短いアンプリコンをつかうのがいいと思います。１００bpぐらいとか。

(無題) 削除/引用 No.8067-3 - 2019/07/11 (木) 04:47:30 - さかな初心者 ＞さかな様 アドバイスありがとうございます。 DNAの抽出溶液はTween-20 0.5%、ProK 800µg/mL、Tris-HCl 50mMを使っております。以前はEDTAも入れていましたが、PCRが動かなくて色々調整した結果これに至った経緯があります。これを20µL使い37度でO/Nした後、翌日95度で10分インキュベート後に1µLをテンプレートとして使っていました（PCRはトータル25μLです）。少なくとも2dpf以降ではこれで上手く行っていたので、変更することが念頭にありませんでした。 水酸化ナトリウムのDNA抽出は存じ上げておりませんでした。次はこれを試してみたいと思います。培養溶液というのも思いつきませんでした。 今後ともどうぞよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.8067-2 - 2019/07/11 (木) 01:42:25 - さかな DNA抽出にはどのような溶液を使っていますか？Porteinase Kを用いた消化以外にも水酸化ナトリウムを用いたゲノムDNA抽出法があり（Meeker et al., 2007. BioTechniques 43: 610）、こちらの方法のほうがPCRの増幅がうまくいくと聞きます。固定したゼブラフィッシュ初期胚からも問題なくジェノタイピングに使えるゲノムDNAが得られています。 抽出液は1サンプルあたり10-20 ulもあれば十分で、液量が多過ぎたりカラム精製のような余計なステップをはさむと十分な濃度が得られない可能性がありますがそのようなことはないでしょうか。 固定せずに胚を切り分けるのであれば、飼育水ではなく細胞培養用の溶液中で行うことで胚が壊れてしまうのをかなり防ぐことができます。ゼブラフィッシュ胚から組織片を分離し培養する方法（https://doi.org/10.1002/dvdy.10395）などが参考になると思います。

1ｄpfゼブラフィッシュのジェノタイピング 削除/引用 No.8067-1 - 2019/07/09 (火) 22:47:36 - さかな初心者 いつも参考にさせて頂きありがとうございます。 ゼブラフィッシュについてアドバイスを頂戴したく書き込みをさせて頂きました。 ある遺伝子のヘテロ同士を掛け合わせて、頭部組織の切片を作成し、Histologyを見る仕事を行っております。頭部を見る仕事ですので、尾側を切ってDNA抽出の溶液に入れ、頭部は固定液の中に入れる、ということをしております。2dpf以降では魚組織が比較的しっかりしてきているのか、未固定のままで切り分けることができ、サンプルを得ることができております。 手こずっていますのは1dpfでして、サンプルがもろく、切り分けるとバラバラになってしまいサンプルとして使い物にならなくなってしまいます。一旦固定後に切り分けるのはできるのですが、それではPCRがかからない、という状況です。固定は当方の共同研究者の指示で2％グルタルアルデヒド＋1.5％PFAを用いています。 当方はもともとマウスのラボで、ゼブラフィッシュを飼い始めたところでして周囲にアドバイスを頂戴できる方がおりません。 何か1dpfを含めた魚類の切り分け、ジェノタイピングにつきTipsをお持ちの方がいらっしゃいましたらアドバイスを頂戴できませんでしょうか。 どうぞよろしくお願い申し上げます。

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