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(無題) 削除/引用 No.8061-9 - 2019/07/09 (火) 05:16:03 - green おおさん、大変ご丁寧にあまりにも有用な文献紹介ありがとうございます。 N末端も意外と厳しいようですね。 E→Dとか、A→Gとかへの変異ならいけるかな？という気もしていますが、実は上の人と相談した結果この系はペンディングにして他のことに集中しようとなったので、後回しになりそうです。 いずれ必要になった時に備え、見識を深めておこうと思います。 繰り返しですが、有益なアドバイス、皆様ほんとうにどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8061-8 - 2019/07/09 (火) 03:25:17 - おお https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4628933/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4847774/ ２つの色の違う蛍光タンパクをつなげて間にPTCを入れるのはポピュラーみたいですね。こっちのほうが楽では？導入効率などの補正もできるし。

(無題) 削除/引用 No.8061-7 - 2019/07/09 (火) 02:18:38 - おお 感覚でいうとGFPは beta barrel structureでその内部の蛍光に携わるアミノ酸の空間的配置を維持していると思われるので、Beta sheetから伸びるループの部分はいじっても影響が少ないと思われる。そんなことを考えると構造を見るだけで大体どこがいじれるかわかりそうなので、こういう質問が出るのが不思議でした。 実際 https://journals.plos.org/plosone/article/file?id=10.1371/journal.pone.0164905&type=printable ここで影響がないアミノ酸が見れるけどBeta sheetにはそういうアミノ酸はすくない。 またこの論文のリファレンスなども参考になると思う。 http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/projects/jonda/structur.htm こちらでは、 Deletion of more than the N-terminal Met or more than seven amino acids from the C-terminus leads to a total loss of fluorescence and the protein does not even have the characteristic absorption spectrum of the intact fluorophore [6]. Probably the beta-can structure cannot be formed even if only a small part of the "can" is missing.

(無題) 削除/引用 No.8061-6 - 2019/07/08 (月) 22:56:29 - green ちなみに「6残基分のDNA」ではなく、アミノ酸にして5残基（2残基・PTC・2残基）、PTCを挟んで6塩基ずつの間違いでした。どうでもいい点ですが訂正しておきたく存じます。

(無題) 削除/引用 No.8061-5 - 2019/07/08 (月) 22:28:48 - green 回答ありがとうございます。 隠すほどのことでもないのに不明瞭な説明でしたが、Premature Termination Codon+/-6塩基ずつを導入して、nonsense suppressionの効果を蛍光を使って見たいというものでして、できれば末端より内部の方がいいのですが、N末端なら一応目的は果たせるのでいいかもしれませんね。 おおさん、全然調べてません(笑)。いや笑い事じゃないですが、自分でも調べつつ、並行して賢者のお知恵をお借りできればと思って投げてみたのですが、丸投げ感がありすぎましたね。 割と急ぎだったので最善手というか効率を求めた感じですが、ちょっとよろしくない態度だったと反省してます。以後気をつけます。 totoさん、dhさん、情報ありがとうございます。ぼんやり6残基ぐらいなんとかなるっしょと思ってましたが、意外と難しいのかもですね。 いずれにせよテストは必須なので、まずはN末端で、PTC以外の4残基を変えて活性を見てみようと思います。 意外となんとかならなそうということに気付けただけでも良かったです。大変助かりました。 皆様どうもありがとうございました…！

(無題) 削除/引用 No.8061-4 - 2019/07/08 (月) 20:28:04 - dh 実験の目的がよくわかりませんが、両末端の6残基（5か7だったかもしれません）欠損は蛍光への影響がほぼないはずです。

(無題) 削除/引用 No.8061-3 - 2019/07/08 (月) 19:19:45 - toto 蛍光が消えるかどうかは立体構造をみても蛍光基以外だとまずわかりません。βバレル構造の中だと6個連続して置き換える事が可能な場所はなかなか見つかりませんが、EGFPやmCherryのアミノ酸配列はそのβバレル構造の外側のリンカーとなる部分も普通はタグ配列に含めるので、両末端はある程度削れます。6アミノ酸だと、EGFPもmCherryもＣ末端にあるMDELYKという配列が蛍光には関係しないので、ここを置き換える事はできます。但し、置き換えた場合には他の蛋白とfusionする際にフレキシビリティが十分とれるような設計が必要です。

(無題) 削除/引用 No.8061-2 - 2019/07/08 (月) 14:25:28 - おお GFPは特に色々な変異を作って蛍光にどのような影響を与えるかや結晶構造など結構論文が発表されていると思いますが、そういうのを調べた上での質問でしょうか

GFPやmCherryで重要なアミノ酸 削除/引用 No.8061-1 - 2019/07/08 (月) 12:17:36 - green GFPとmCherryに、アミノ酸にして6残基分のDNA配列の変異を入れたいのですが、なるべく蛍光活性に影響がない部位に導入したく思っています。 導入したい変異の1つはGAGでグルタミン酸をコードするのですが、両者とも何となく酸性アミノ酸が目立つ気がするため、ここを軸に、他5つのアミノ酸は多少変わっても目を瞑ろうかと思っています。 これらの蛍光タンパクの内、どこか絶対に変異を加えてはならない領域があるなど、もしご存知の方がいらっしゃいましたらご指摘いただけると大変ありがたく存じます。 よろしくお願いします。

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