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(無題) 削除/引用 No.8059-9 - 2019/07/09 (火) 11:54:37 - おお >また、アンドロゲン非依存性のDU-145細胞においては、細胞増殖抑制は認められません。その為、LNCaP細胞がアンドロゲンに応答しない変異をしていると考えております。 この結論になぜ至ったのかよくわからない。

(無題) 削除/引用 No.8059-8 - 2019/07/09 (火) 11:52:27 - おお ま、いいんですけど前に示した論文のChart 4. をみましたか？

(無題) 削除/引用 No.8059-7 - 2019/07/09 (火) 05:21:44 - こいけ 細胞増殖効果が見込まれるんですよね。WST-8アッセイですので96穴プレートに播種していると思います。ほかの方が指摘しているようにまずは細胞数を減らして、1日後、2日後。。。と細胞の様子をごらんになるといいかと思います。もしかしたらコントロールは普通だけどDHTは増殖しすぎてオーバーコンフルエントになっているかもしれませんし。LNCaPはそもそもよく増える細胞でしょうから。 10%FBSも実験しているときはFBS量を減らすかなくすかしたほうがいいかと思います。そもそも10%ある通常の状態でよく育つ条件ですので、これがないと増殖はゆっくり、あるいは増えないけどDHTを加えることでFBSがなくても増殖が早まりました、効果ありです、と比較もしやすく言いやすいと思いますよ。 播種するときにDHTを混合させていいのですね？あまりDHTのことを知りませんが、自分だったら最初の播種は通常の10%培地で全体的に行い、次の日に培地をFBS少な目（あるいはなし）でDHTあるなしの培地に変えて数日後にWSTアッセイするかな、と思いまして。 効果ありとされている論文の実験方法を今一度確認して先生や先輩方と相談されるといいと思います。

(無題) 削除/引用 No.8059-6 - 2019/07/08 (月) 07:59:53 - 学部4年生 様々なご意見有難うございます。私がお世話になっている研究室において、他にLNCaP細胞を用いている方がいないため、大変助かります。 現状の情報に関して、至らぬところがありましたので、補足いたします。 【前任者の実験に関して】 �@　前任者により、一度だけDHTによるLNCaP細胞増殖が認められております。 　　論文では、1 nM周辺で細胞増殖が認められるとのことですが、前任者の実験においては、1 µM、10 µMにて細胞増殖が認められました。 　　また、前任者実験において、チャコール処理していないフェノールレッド含有培地を使用されています。その後の再現は取れていません。 �A　前任者により、その後の実験において、DHTによる細胞増殖抑制が認められています。 　　その後の実験において、細胞数の減少が認められました。 �B　後任者（質問投稿者）により、細胞増殖抑制が認められています。 　　以下の条件は、後任者により検討を行ったものです。 　　１、培地交換なし 　　２、チャコール処理フェノールレッド含有培地 　　３、チャコール処理フェノールレッドフリー培地 　　４、細胞播種濃度の検討（論文より計算し、その1/2および2倍濃度も検討） 　　５、DHT添加濃度（0.1 〜 1000 nM） 　　６、若い細胞株の使用、古い細胞株の使用（バッチも変更） 　　７、DHTの用事調整 　また、アンドロゲン非依存性のDU-145細胞においては、細胞増殖抑制は認められません。その為、LNCaP細胞がアンドロゲンに応答しない変異をしていると考えております。 　 　現在、チャコール処理FBSフェノールレッドフリーRPMI-1640培地の血清量を減らすことを行っていないため、これを次に確認しようと考えております。

(無題) 削除/引用 No.8059-5 - 2019/07/07 (日) 05:48:17 - おお もしチャコール処理FBSで維持されていたならアンドロゲン非依存性のSubpopulationがドミナントになってきている可能性があるのでは？

(無題) 削除/引用 No.8059-4 - 2019/07/07 (日) 03:55:24 - おお 無責任にいえることを並べてみると 細胞のバッチをかえてみる。 他の細胞をためしてみる。 血清濃度を下げてみる。 血清のロットをかえてみる。 細胞を撒く量を減らしてみる。 うまくワークしている研究室からもらう 買いなおす。 http://cancerres.aacrjournals.org/content/43/4/1809.full-text.pdf これとか参考になります？

(無題) 削除/引用 No.8059-3 - 2019/07/07 (日) 02:18:48 - = 現象自体はいろんな論文で報告されてるので嘘ということはないでしょう。亜株によって感受性は違うようですが。 この系で既に前任者の結果が出てるのか、それとも質問者さんが条件検討をしている段階なのかいまいちよくわかりませんが、何れにせよボスかスタッフに相談しましょう（当然されてるとは思いますが）。 3ヶ月間で相当いろいろ試されてると思うので、逆になさそうな点でいうと、手書きのμとmがわかりづらくて実は1000倍濃度が違うとか。ざっと見ただけですが高濃度だと増殖が抑制されるようですので。 細胞の状態は毎日チェックしてどうなってるのか見てみるのがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.8059-2 - 2019/07/07 (日) 00:30:50 - み 前任者や上司に相談されましたか？同じラボで単純な実験が再現できないのは色んな意味でその程度の微妙な現象をみているのかなあと思う。 念のため、アゴニストは失活していないか。作り直す。 細胞の性質が変化したとか。 WSTはﾐﾄｺﾝﾄﾞﾘｱの活性をみているだけだから細胞数以外のﾌｧｸﾀｰが影響する。単純に細胞数カウントしたらどうですか。 1nMとか低濃度だとストックの状態や手技で濃度がぶれるでしょうから濃度ふってみて、いずれの濃度でも増えないなら前任者のデータ疑った方が良いかも。 疑って文句言われるなら前任者に目の前でデモンストレーションしてもらってデータ取り直しを要求するとか。

LNCaP細胞に対するアゴニスト作用が認められません 削除/引用 No.8059-1 - 2019/07/06 (土) 21:33:36 - 学部4年生 4月に前任者より、テーマを引き継ぎました。 前立腺がん由来細胞株LNCaP細胞に対して、細胞増殖促進するアゴニスト（DHT）を添加すると、細胞増殖が抑制されてしまいます。 3か月ほど、論文に基づいて様々なことを試しましたが改善が見込めず、ご助言ください。 【現在の条件】 細胞種：LNCaP細胞　（アンドロゲン依存性前立腺がん由来細胞株） 培地条件：10%チャコール処理FBS含有RPMI-1640培地（フェノールレッドフリー） 細胞数アッセイ：WST-8アッセイ DHT濃度：0.1 〜 1000 nM(DMSOに溶解) Day 1：　DHT混合培地に、LNCaP細胞播種 Day 3：　培地交換 Day 5：　WST-8アッセイ 【補足】 　培地交換による影響を考え、培地交換を行っていない条件においてDay 5に測定を行った際も、コントロールに比べ細胞増殖抑制が認められました。 （この時の条件は、フェノールレッド含有でした） 　論文によると、1 nMにおいてDay 5の測定で、細胞増殖促進が認められるようです。

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