はじめまして。D2の学生です。
ショウジョウバエを用いて研究をしています。
現在pUASTattBベクターにとあるたんぱく質の遺伝子を組み込み、トランスジェニック系統を作成しようとしています。
まず、cDNAライブラリを鋳型に、足場3bases-EcoRI-kozak-CDS-BglII-足場2basesとなるようにPCRで産物を増やしました。
これをTAクローニングでいったん増やし、再びEcoRIとBglIIで切り出してpUASTattBベクターに移し替えようとしています。
TAクローニング後に制限酵素消化したインサートとpUASTattBベクターは目的の位置にバンドが見え、その一部を電気泳動にかけてモル比を整えてライゲーションを行いました。
このライゲーションまではうまくいっているようでして、かなりの数のコロニーが生えてきます。
しかし、ミニプレップ後にSalIで制限酵素消化をしたところ、本来なら4本バンドが見えるはずが、2本しか見られず、どうもそのバンドの位置も全然違うのでです。
コンタミなども考えはしましたが、どのクローンをつついてもそんな結果になってしまい、これはライゲーションにエラーがあるのか、SalI処理にミスがあるのか…困ってしまいました。
いったい何が起こっているのでしょう。
今後何度も同じ手順で系統を作っていくのですが、ここで躓くと大幅なタイムロスで、かなり焦っています。
実は過去に１度だけ作ったことがあるのですが、その時は問題なく作成でき、そのプロトコルと全く同じやり方で今回もやっています。
何かご意見いただけるとありがたいです。 |
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