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(無題) 削除/引用 No.8054-26 - 2019/07/14 (日) 15:56:30 - yamyam 皆様 もう一度やり直して、無理そうならIn fusion試してみます。 ありがとうございました。 また上手くいったら書き込みます。

(無題) 削除/引用 No.8054-25 - 2019/07/14 (日) 01:30:36 - おお ついでだからもう一つ知り合いの経験を言っておきます。 プラスミドにインサートを入れているけどどうしても入らないというのですが、プラスミドはちゃんと切れてるし、そのほか酵素処理も問題ないし、プロセスはへんなことしてないという不思議なことが起こってました。 何気にプラスミドのオリジナルからTransformationしてプラスミドを精製し直して、再度やるとインサートがとれたらしいです。 最初に使ったプラスミドはオリジナルのプラスミドからどこか変わってしまったのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8054-24 - 2019/07/12 (金) 01:17:16 - おお そのどうしても切れないプラスミドですが、たとえばS2 Cellsなどに入れてWBで発現確認とかできないですか？ ちょっとした意味があるかわからない変更でもうまく行ったいるすることもあります。例えばコンピの大腸菌株を変えてみるとか。例えばBgl II切り出し、ブランとにしてからEcoRIで切ってブランとーEcoRIで入れるとか。PCRプロダクトを直接pUASTattBに入れるとか。 なんかいつものように行ってないなと思うときは、色々見直しながら同じデザインでやると同時に、PlanB的なデザインも並行してやることを勧めています。できれば最初から２種類ぐらいのデザインで並行してやるくらいがいいです。 予期せぬところにEcoRIやBglIIがある、またはできているということはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.8054-23 - 2019/07/11 (木) 21:50:55 - んん >もういっそIn-Fusionとかで直に入れてしまうとかだとダメかな 本橋先生の開発されたSliceクローニングも良いですよ。 低コストでin fusionができ、先生には感謝しかありません。

(無題) 削除/引用 No.8054-22 - 2019/07/11 (木) 16:48:35 - あ もういっそIn-Fusionとかで直に入れてしまうとかだとダメかな

(無題) 削除/引用 No.8054-21 - 2019/07/11 (木) 13:04:02 - seventh 制限酵素はDNAの状態の影響を受けやすかったりするので、シーケンシング等の他の方法を試しては？ 制限酵素で切っても長さが解るだけなので確認法としては確実性が高いわけではないですし。

(無題) 削除/引用 No.8054-20 - 2019/07/11 (木) 12:53:59 - yamyam インサートのみのPCRだとバンドが出るのですが… 相変わらず制限酵素処理ではバンドの位置がおかしいです 病みそう…

(無題) 削除/引用 No.8054-19 - 2019/07/06 (土) 18:23:05 - yamyam おお様 そうなのですね。 一回試薬を変えてみたいと思います。 他にも似たような経験ある方いらっしゃいますか？

(無題) 削除/引用 No.8054-18 - 2019/07/06 (土) 03:01:52 - おお >[Re:17] yamyamさんは書きました : > http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=6368 > これを見る感じ、100％おかしくなることはないみたいですね。 > ますます謎です。 わたしの場合は切断パターン通りのバンドがまったくなかったです。

(無題) 削除/引用 No.8054-17 - 2019/07/06 (土) 00:53:44 - yamyam http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=6368 これを見る感じ、100％おかしくなることはないみたいですね。 ますます謎です。

(無題) 削除/引用 No.8054-16 - 2019/07/06 (土) 00:50:20 - yamyam おお様 電気泳動、UV照射に関しては大丈夫です。 これだけ同じバンドが得られると、クローニングには成功しているけれど確認実験が失敗しているのではないかと思えてしまいます。 再度形質転換する案、ありがとうございます。 ただ、同じプロトコルで行うと、次の抽出でまた同じことが起こってしまうのではないか…と。 アルカリの話が出ましたが、Miniprepの試薬を変えたらうまくいくなんてこと、ありますかね…？

(無題) 削除/引用 No.8054-15 - 2019/07/06 (土) 00:40:30 - おお それぞれインサートとベクターは電気泳動して切り出していますよね。 またUV照射はなるべくしないようにアルミホイルでバンドの一部だけ露出させて位置を確認するとかしてますか？ もしかしたらプラスミド精製のとき最初のアルカリ処理が強すぎて制限酵素耐性になってしまっているかもしれません。ほとんど起こったことがありませんがこれまで一度だけ経験しています。後でそういうことがあると聞いておそらくそうだったんだなと、その時はそのへんなプラスミドをもう一度Transformationしたら期待するプラスミドがとれたのでそういうことだったんだなと。 そういうことなら更にいくつか拾ってミニプレップすればいいかと思います。ただ対処方法は実際に条件検討をしたことがないのでなんとも言えないですけど。もしSol Iにグルコースが入ってなければいれてみるとかあとは迅速にやるとか、温度管理とかでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.8054-14 - 2019/07/05 (金) 23:59:49 - yamyam 中年様 まさしくその通りです。 組み換えなんてそんなに起こるものなのでしょうか。 例えば５つピックアップしてみて制限酵素消化をしたところ、 ４つは全く同じバンドで謎の位置の2本 １つは明らかに小さいbaseの位置に1本 のようになってしまいます。 SYBR master様 成功したベクターと同じ条件（量的にも）で消化しても謎のバンドが出てしまいます。 mmom様 4,5個程度でして、ここから切れ残りは存在していないと判断しました。

(無題) 削除/引用 No.8054-13 - 2019/07/05 (金) 16:42:26 - mom 制限酵素消化したpUASTattBベクターだけのライゲーションでは、どれくらいコロニーが出たのでしょうか？　インサートを追加したときより遙かに少ないですか？

(無題) 削除/引用 No.8054-12 - 2019/07/05 (金) 15:24:25 - SYBR master Sal Iはsuper coil状態のplasmidを切断するのに、直鎖の10倍量のunitsが必要です。酵素不足では無いですか？

(無題) 削除/引用 No.8054-11 - 2019/07/05 (金) 15:17:47 - 中年 部分シークエンスによれば正しい空ベクター、しかし、制限酵素消化パターンは本来の空ベクターのサイズより小さいということでしょうか。 制限酵素の取り違えなどのつまらないエラーの可能性が排除できるのであれば、それはそのベクターが大腸菌内で不安定なせいでおかしな組換えが起こっているのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8054-10 - 2019/07/05 (金) 15:02:18 - yamyam 私もベクターの選択ミスやコンタミを疑ったのですが、過去に上手くいったベクターからインサートを切り抜いていますので、その線は無いです。 また。その直鎖ベクターを、SalI処理すると目的の位置にバンドが出ます。 もっと多くのコロニーをつついて、一個でも上手く入っていたらいいやという路線で数こなすべきでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8054-9 - 2019/07/05 (金) 14:34:50 - seventh pUASTattBをSalIで切って確かめているようですが、これインサート無しでも4本バンドが出るっぽいですね。ベクターを取り違えているのでは。うまく切れてないだけかもしれないですが。

(無題) 削除/引用 No.8054-8 - 2019/07/05 (金) 14:08:52 - yamyam 皆様 ご意見ありがとうございます。 もちろん先生にも聞いていますが、こんなのは初めてでなぜかわからないとのことでお手上げ状態です。 TAベクター時点でのシーケンシング結果が今朝出まして、目的産物がしっかり増幅されていました。 pUASTattBベクターのシーケンシング用のプライマーでPCRを行ったのですが、ベクターと思われるバンドしか得られなかったため、おそらくインサートが入っていないと思われます。 10個くらいのコロニーを使ったのですが、いずれもダメでした。

(無題) 削除/引用 No.8054-7 - 2019/07/05 (金) 14:06:07 - 中年 TAクローニングしたプラスミドはSalIで消化して予想されるバンドが出るんですか？

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