全20件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.8050-20 - 2019/07/08 (月) 16:09:12 - 新米研究者 ありがとうございます。 念のためtagをつけた抗原のプラスミドは作成してあるので、今研究室内で起きている細胞で目的タンパク質の発現比較をした後トランスフェクションしようと思います。 また並行して皆さんのアドバイスを参考に生理的条件で見えそうな条件も模索していこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.8050-19 - 2019/07/08 (月) 14:53:20 - おお ＞相互作用先のタンパク質に関してもWBから発現に問題ないと考えていました。 発現しているということと、実験で使うのによりよいというのはちがうとおもう。もし同僚がたまたま同じタンパクを違う細胞でもっと発現しているデーターをもっていて、こっちの細胞使ったほうがいいんじゃない？っていわれたらどう？ ＞tagをつけて発現させてやるのも手だとは思いますがまずは生の状態で検出できることがベストだと考えています。 ベストってなんにたいして？ 実験デザインとしてよりいい一つの尺度はデーターが取りやすいこと。 もちろんTagのない、さらに人為的に発現してないもので検出されるというのは生理的現象を示すには理想だけど、Tag入れたりした系でデーターが取れれば、他の実験結果などから判断してより理想的な系でやってみる手もあるし、そういう場合はもうすでにIPでなくてもかまわない。タンパク複合体がみれるほかの手技もあるし、免染での共局在でも（Interactionをみているとはいえないけど）、可能性を示唆するデーターとしてつかえ、より強い主張が出来るでしょう。 ただ確かにTagを入れたからうまくいく保障はないけど。デメリットもあるから。

(無題) 削除/引用 No.8050-18 - 2019/07/08 (月) 14:37:47 - おお Light chainスペシフィックな二次抗体もあるよ。理論的には２５ｋDaあたりにしか抗体は検出されてない。

(無題) 削除/引用 No.8050-17 - 2019/07/08 (月) 10:03:40 - 新米研究者 返信ありがとうございます。 質問の内容もまだまだ未熟ですいません。 目的タンパク質の分子量は75kDaです。 ゲルは7.5%を使用しています。 とりあえずbufferと抗原抗体反応の順番を検討したいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.8050-16 - 2019/07/08 (月) 09:40:08 - mom 他の方も指摘していますが、タンパク・タンパク相互作用（抗体・抗原相互作用も含む）は酵素反応と同様塩濃度の影響を受けます。 抗体・抗原の場合は、結合すると塩濃度の影響を受けにくくなる相互作用もありますが、デリケートなものだと考えておいても損はないでしょう。 昔先輩から、0.5x, 0.75x, 1x, 1.25x, 1.5x PBSあたり（あるいはもっと細かく）でベストなIP条件を探すと良いと聞いたこともあります(制限酵素と同様だとも）。 まあ、大抵1xで済んでいることが多いので実践していませんが。

(無題) 削除/引用 No.8050-15 - 2019/07/08 (月) 02:51:19 - み 46kDaの蛋白ですか、heavy chainは50-55くらいですよね。重なるかどうかはあなたの結果を見ないと分からない。heavy chainでにくくする試薬売ってますね。最近の同様のトピックで皆さんコメントしているので参考にされると良い。 しかしそもそも安定発現させている外来蛋白に内在性の相手蛋白を引きずり落とす現状ならタグ付きを安定発現させて免疫沈降効率を上げるなり、あえてgfpなど大きめのタグ付きでheavy chainと重ならないようにするのも手です。 7.5%辺りの薄めのゲルで泳動展開させれば46とheavy chainは重ならないかもね。 まあ6ugもロードしてたら太いバンドで邪魔するかもだけど。 免疫沈降効率上げるにはIPする段階で塩濃度を生理的濃度にまで下げて4度で一晩やってみたらいいんじゃない？ そもそもIP能力の悪い抗体かもしれないし、その時は抗体変えるかタグでやった方がよいかも。所詮、外来蛋白と内在蛋白の相互作用見てる段階ですよね。 タグ付き安定発現細胞作れば核内での共局在とかも見やすいだろうし。 ところで相手方の分子量はナンボなの？可能な限り情報全て開示しないと余計なことまで指摘しないといけないんだな。分子量次第でゲル濃度からして条件変わってくる。 相手方に関してはTotalでも共沈降レーンでもまともなバンドが出ていないようですね。WBの結果から大丈夫と判断したとか書いてあったけど矛盾してるよね。 発現量自体が少ないのか、抽出条件が悪いのか、DNA混入して尾を引いて乱れているのか、抗体の検出力が低いのか、腕が悪いだけなのか。糸引くようなら軽くｿﾆｹｰｼｮﾝかけてDNA剪断した方がよいかも。 これら全てに問題ないなら根本的に高発現細胞を見つけた方がよいかも。 それとリバースIPは検討したのかな。

(無題) 削除/引用 No.8050-14 - 2019/07/07 (日) 17:46:43 - 新米研究者 うちの研究室で免疫沈降の知識を持った人が皆無のので非常に助かります。 本当にありがとうございます。皆様の言う通り、次から次へと条件を変えているせいで最適化という言葉を使うには程遠い状態でした。実際にやったことのある方から話がいただけるのはとても勉強になります。 抗体量 6ug は固定したいと考えています。使用抗体はモノクローナル抗体を用いています。 ビーズー抗体反応　20分 抗原抗体反応　　　2時間 すべて室温でやっています。 免疫沈降の効率を上げるためにはどこを調節すればよいか考えのある方は意見お願いします。

(無題) 削除/引用 No.8050-13 - 2019/07/07 (日) 17:39:08 - 新米研究者 皆様回答ありがとうございます。 まず自分が抗原としているタンパク質が46kdaの分子量であり、ビーズと抗体を架橋してから抗原と反応させています。IP効率が悪いという意見が多く先に抗原抗体反応を行ってからビーズと反応させる手法のほうが良いのかもしれないと思っていますが、その場合溶出された抗体と抗原のタンパク質が被ることが懸念です。 またライセート調整に関してはRIPAや核抽出なども試しましたが、今のところ一番可能性が高かったためこのbufferを使っています。皆様の話を聞いて塩濃度を落として条件検討してみたいと考えています。 使用している細胞は抗原の安定発現株で抗原の発現自体には問題ないと考えています。相互作用先のタンパク質に関してもWBから発現に問題ないと考えていました。tagをつけて発現させてやるのも手だとは思いますがまずは生の状態で検出できることがベストだと考えています。 まずは各反応時間を再検討する必要がありそうです。今の抗体量でO/Nは試したことがないので試してみます。 あと二点だけ質問したいのですが、まず1つ目が自分が抗原としているタンパクの分子量的に架橋操作をしなければやはり抗体と被ってしまうものでしょうか。その点が怖くて先に抗体抗原反応を行えずにいます。 もう一点、抗体の検出感度についてなのですが、相互作用先のタンパク質のWBでなぜかバンドが端に偏ってうまくバンドとして検出できず黒い2つの点のようになっています。Inputはかろうじて真ん中の部分にバンドが表れていますがそれでも端によっています。これは抗体のせいなのかそれとも使用しているbufferが悪いのか考えられることはありますか。

(無題) 削除/引用 No.8050-12 - 2019/07/07 (日) 07:32:56 - おお >また抗原のWBで5%inputに対する免疫沈降物のバンド強度で比較すると1.5倍ほどです。 これはIPで使っている抗体に対しての抗原ですよね。それならIPの効率が悪いのではないでしょうか。 ぎゃくにWBのときの抗体に対する抗原（IPで共沈してくると期待しているもの）であればもともと発現量が弱いか抗体の検出感度が弱いか。この場合はOverexpressionかその蛋白がもっと発現している細胞がないか探すか。抗体の検出感度の問題なら抗体を変える。 よく発現している細胞を選ぶのに手持ちの細胞で発現量比較なんかもしてみるといいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8050-11 - 2019/07/07 (日) 06:24:27 - おお >NaCl 0.3Mの間違いだとすると高いですね。150mM以下で良いでしょう。 0.3Mはクロマチンが壊れるか壊れないかの濃度でMg存在下でこの濃度は溶液がどろどろにならずに核蛋白を溶出する方法としてこのあたりの塩濃度はよく使われます。ただご指摘のようにこの塩濃度でIPする必要もないので生理的に近い塩濃度にバッファー置換するか薄めてからIPという手はあるとおもいます。あるいはビーズ洗浄のときは塩濃度をさげるか。もちろん生理的な塩濃度で抽出が可能ならそんなことをする必要もないですけど。 核を単離してから抽出しているのでしょうか？もししてないならそうするのも手でしょう。

(無題) 削除/引用 No.8050-10 - 2019/07/07 (日) 06:14:24 - おお IPでバンドが見えて結合したとどれほど認めてくれるかという観点で少し？です。いろいろなアプローチの一つで、IPもPublicationのレベルに持っていきたいという質問ならIPの改善という事だけの回答を求めているのかもしれませんが、他のアプローチを全く考えないでIPばかりに時間を費やしているなら無駄になっている時間があるかもしれません。 他のInteractionに関して示唆的なデーターもあるとか、取っ掛かりで可能性を考えたいのならTagを入れた（入れなくてもいいけど）発現ベクターを使いOverexpressionして見るてもあると思います。 また抽出条件がInteractionに不利に働いているならCross linkerを使うてもあります。生理的に近い条件でCross linkerを加えてLysisするのですが、架橋されているので非常に強い可溶化方法でも構いません。それのよくわかりやすい例はChip assayです（相手がDNAですが）。架橋剤はホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、その他たくさん種類がありますので一度勉強されるといいでしょう。架橋剤によりSDSで変性しても架橋された分子ははずれないので両タンパク質の分子量の合計以上の大きさに両方の抗原性をもつペプチドが検出されるようになります。架橋が外れる物もありDSPなどは比較的安価です。

(無題) 削除/引用 No.8050-9 - 2019/07/07 (日) 00:06:06 - み 核蛋白でも塩濃度を高くしないと抽出されないとは限らない。色々試して抽出効率、共沈降効率を検討すれば良い。 一般的な方法は試されて実際に高塩濃度にしないと抽出されないのですか？ 抗体を先にビーズにトラップすることが正しい方法かは抗原抗体の相性によるだろうし20分でじゅうぶんなのかも検討するほか判断できない。多くの研究では抗原抗体反応をさせてからビーズで回収したりもしています。 これは人それぞれの好みによるところが大きいでしょうが。 立体障害云々と懸念するコメントも出ていますよね？ 色々試していると言っている割には未だに何をどれだけ検討したのか全く分からないし、あなた自身も最適化できているか分かっておられないようですね。 それって何もやっていないのと殆んど変わらないように聞こえるのですよ。 培養細胞と組織とでもやり方変えないと上手くいかないことがあると思いますが、いったい材料は何なのでしょうか。 既報論文を参考にされているようですが、同じ方法で上手くいくのならそれで良いじゃないですか。しかし上手くいってないのですよね？免疫沈降効率悪そうですし。 科学したいならもう少しまともな情報開示をして論理的に説明しないと議論になりません。 他の人も既に疑問点は挙げられていますよね。

(無題) 削除/引用 No.8050-8 - 2019/07/06 (土) 21:29:32 - 新米研究者 返信ありがとうございます。 bufferは他のも試してはいるのですが、自分の見たいタンパク質が各たんぱく質であることから塩濃度は高く設定しています。しかしそのせいでタンパク質相互作用が壊れている可能性があるので、そこは懸念材料です。また自分の見たいターゲットタンパク質をみている論文を参考にしているというのもあります。 最初は相互作用するかもわからないたんぱく質でしたが、薄いバンドは得られているため相互作用していることにはしてそうなのですが、いまいちよいデータが得られていません。 ６ug使用して、それほどつれてきていないということはビーズと抗体の反応時間が短いのが原因なのでしょうか。使用している抗体はIPに対応している抗体を使用しています。

(無題) 削除/引用 No.8050-7 - 2019/07/06 (土) 19:51:46 - み >[Re:6] 新米研究者さんは書きました : > 返信が遅くなりすいません。 > buffer組成はHEPES 20mM pH8, EDTA 0.2mM, NaCl 0.3 mM, NP40 0.5%, 15% glycerolです。 NaCl 0.3Mの間違いだとすると高いですね。150mM以下で良いでしょう。 > また抗原のWBで5%inputに対する免疫沈降物のバンド強度で比較すると1.5倍ほどです。 > 6ugも使用していてそれなら効率悪いですね。しかし、それでも薄い共沈降バンドが見えているならやりよう次第で改善できそうだけど。 > 反応時間を延ばした際にタンパクが分解するリスクはないのでしょうか。 分解気にするなら室温やめた方が良い。4度で反応時間長くしても良い気がする。やってみないと何とも分からんが。 色々条件変えてやっても上手くいかないとか言っているわりにはbuffer塩濃度からして一般的でないし、その他の点でも全然最適化されてないのだろう。

(無題) 削除/引用 No.8050-6 - 2019/07/06 (土) 16:53:48 - 新米研究者 返信が遅くなりすいません。 buffer組成はHEPES 20mM pH8, EDTA 0.2mM, NaCl 0.3 mM, NP40 0.5%, 15% glycerolです。 また抗原のWBで5%inputに対する免疫沈降物のバンド強度で比較すると1.5倍ほどです。 反応時間を延ばした際にタンパクが分解するリスクはないのでしょうか。 自分で調べてはいますが実際に経験のある方の意見は参考になるので、ご協力よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.8050-5 - 2019/07/06 (土) 05:37:31 - おお 気になる点がいくつかあるのでちょっと答えにくくなってますが、 まずIPする抗体にたいする抗原の発現量 その抗原がIPでちゃんと回収されているか IPで調べたい抗原の発現量 ＞またビーズと抗体の反応時間は20分。抗原抗体反応は室温で2時間 Lysateに直接抗体をいれてビーズを加えるとどうでしょうか。 IPの抗体が立体的障害によりComplexの形成を阻害している場合やComplex形成により抗体認識部位が隠れてしまう場合もあるので、そういう場合はすこし手を変える必要があるかも。IPとWBの抗体を逆にするとか、違う抗体をさがすとか。 ＞抗体量は6ug、タンパク量は500ug その抗体量だったらタンパク量（多分トータルの量と思うが）は数倍増やしても（その他は同じスケールで）行けそうな気がする。もちろんノンスペの出具合なども影響してくるでしょうけど。２mgくらいでもなんとかなるんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.8050-4 - 2019/07/05 (金) 05:41:39 - mom 架橋剤を試す。 www.learningatthebench.com/crosslinking-protein-interaction-analysis.html

(無題) 削除/引用 No.8050-3 - 2019/07/04 (木) 21:42:14 - 1234567 IP自体はうまくいっているのですか。パートナーはともかくとして抗原分子は捕まえられていることは確認していますか。IP精製物の中に抗原分子は検出できているけど、パートナーがうまく一緒にIPできていないようだということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8050-2 - 2019/07/04 (木) 19:37:26 - み 高感度ECL検出試薬を使用する。 使用している抗体の免疫沈降効率は良いのでしょうか？濃縮されているのか？ 室温で良いのか疑問。 4度で長めにやるとか。 Buffer組成くらい書いた方が良い。

Co-IP バンドが薄い 削除/引用 No.8050-1 - 2019/07/04 (木) 19:21:05 - 新米研究者 お世話になっております。 現在タンパク質相互作用を見るために、共免疫沈降をしています。buffer条件や反応時間などを変更して検討を重ねていますが、なかなかきれいなバンドを得られていません。検出はWBで行っています。抗体量は6ug、タンパク量は500ugで行っています。またビーズと抗体の反応時間は20分。抗原抗体反応は室温で2時間で行っています。ネガコンのIgGのバンドは見えていません。濃いバンドを検出するために何か改善策はありませんか。

全20件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---