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(無題) 削除/引用 No.8044-12 - 2019/07/07 (日) 19:09:24 - あの プライマーの設計を自分でし直した方が良いと思います。 論文ででているものがベストとは限らないし、著者が配列のスペルをタイプミスしてることだってありえる。 自分で設計する場合は、次を意識すること。 (1)イントロンエクソン構造を考慮すること。 最低でも、同一エクソン内に両プライマーがアニールしないようにする。 さらに、もし可能なら、エクソンと別エクソンにまたがるようにする。 これはNLBCで配列の横のピックプライマーから進む先のprimer3で設定する。 (2)増幅産物の大きさは、出来るだけ50〜150bpにすること これもPrimer3で設定する。

(無題) 削除/引用 No.8044-11 - 2019/07/03 (水) 11:39:32 - SYBR master >[Re:1] もももさんは書きました : > この現象についてラボ内にエアロゾルが存在する、cDNAの溶液が跳ねてコンタミしているなどを考えましたが目的遺伝子のNTCについては増幅が見られないため原因はこれではないと考えています。 電気泳動と溶液調製の部屋を分けてますか？あと、オートクレーブの部屋も別ですか？過去に、溶液調製のベンチの裏だかそばにあったオートクレーブの蒸気中に含まれていたDNAがコンタミの原因であるとの報告があります。 > 仮にエアロゾルが舞っていたとして、ハウスキーピングだけを増幅するようにコンタミするか。または反応液を調整するチューブが駄目なのか（ミリQを入れてボルテックスするとnanodropでなぜかDNAが検出される）。ハウスキーピングの発現が多すぎて正確に検出できていないのか。 空気中のDNAは、静電気で容易にプラスチック表面に吸着します。たぶん、nanodropで検出できるとなると、かなりの量が付着しています。ただ、この場合のDNAは主に実験者などのヒト由来のgenome DNAであることが多いです。 電気泳動でウェルから漏れたDNAが泳動bufferの蒸発と共に、空気中に拡散されチューブに付着した、と予想しますが、TATAbox binding protein(TBP)だけがNTCで取れないのであれば、日常的にTBPのPCR productsを泳動していませんか？

(無題) 削除/引用 No.8044-10 - 2019/07/03 (水) 11:27:33 - SYBR master いくつかに分けます。 >[Re:1] もももさんは書きました : > 検量線の溶液には試料から抽出したRNAを逆転写したcDNAを使用しており、濃度は逆転写前のRNAから、12.5ng/ulです。 RNAの純度について検討はされていますか？量がそこそこ取れるなら、電気泳動で、2つのrRNAの比、18Sと25Sが１対２になっていますか？吸光度だけでは検討としては不可です。あと、逆転写に用いたprimerは,oligod(T)ですか、ランダムプライマーですか？ > 目的遺伝子である植物のフィトクロムなどでは希釈系列は正しく検量線を描き、100%前後の増幅効率を示し、NTCは増幅しません。 > しかし、ハウスキーピング遺伝子について、Elongation factorでは増幅効率がマイナスになり、TATAbox binding proteinでは数万%という極めて異常なものとなってしまい、また、NTCも増幅されるという結果になります。 各々のCt値を教えてください。効率がマイナスになる場合、濃すぎて上手く取れないことが一度ありました。NTCが出るのはTATAbox binding proteinだけですか？

(無題) 削除/引用 No.8044-9 - 2019/07/03 (水) 00:43:03 - ももも AP様 リアルタイムPCR産物をアガロースゲル電気泳動しております。このときバンドは一本、スメアがないものが得られました。 エンドポイントPCRについては聞いたことがないのでよろしければどのようなものか教えていただけますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8044-8 - 2019/07/03 (水) 00:39:55 - ももも おお様 方法のご提示ありがとうございます。指導教員に相談して対応していきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.8044-7 - 2019/07/02 (火) 23:41:22 - AP いきなりreal-time PCRじゃなくて、事前にendpoint PCRで泳動パターンを 見たことは？ あるいはreal-time PCRした後に泳動したことは？

(無題) 削除/引用 No.8044-6 - 2019/07/02 (火) 23:39:51 - おお 配列を読むか、もっとざっくりなら制限酵素で切って期待通りの切れ方をするか。ただしよく切れる酵素を選ぶこと。

(無題) 削除/引用 No.8044-5 - 2019/07/02 (火) 22:54:43 - ももも おお様 Tm値、バンドからは異常が見られないものの、プライマーダイマーの可能性について完全に否定できるわけではないのが痛いところです。 これら以外にプライマーダイマーと目的の増幅の見分け方があればよろしければ教えていただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.8044-4 - 2019/07/02 (火) 22:38:40 - おお それで否定できますか？

(無題) 削除/引用 No.8044-3 - 2019/07/02 (火) 22:12:01 - ももも おお様 考えていただきありがとうございます。 プライマーについて、記述しておりませんでしたがハウスキーピングのものは2遺伝子とも論文から引用したものであります。また、メルトカーブのピークは単一、2%アガロースゲル電気泳動ではバンドは一つでしたのでダイマーの可能性は低いと思っております。

(無題) 削除/引用 No.8044-2 - 2019/07/02 (火) 21:59:46 - おお プライマーダイマーとかがふえてるのかな

リアルタイムPCRのハウスキーピング遺伝子の検量線が変になる 削除/引用 No.8044-1 - 2019/07/02 (火) 21:21:43 - ももも ご質問させていただきます。 只今私は大学学部の研究でリアルタイムPCRを用いた発現解析を行っております。 この度は希釈系列を用いたCt値による検量線について、ある遺伝子について増幅効率がマイナスになること、また、別のある遺伝子について異常なほど大きい増幅効率が出ることが問題になっており、それについて何らかの助言をいただけないかと思っております。 検量線の溶液には試料から抽出したRNAを逆転写したcDNAを使用しており、濃度は逆転写前のRNAから、12.5ng/ulです。 PCRのときには8連チューブのウェルあたりミリQ水を10ul、SYBRgreenを12.5ul、各プライマーを0.25ulずつを1.5mlチューブ内で調製してから分注し、2ulの希釈系列cDNAを各ウェルに入れています。 希釈系列を作るチューブはDNA低吸着で、チップも同じく、フィルターがついているものを使用しています（分注前の反応液を作るチューブは別の物を使っています）。 PCRによる増幅は起きており、増幅曲線は次第に増幅しサイクルが進むと水平になり、メルトカーブのピークは一つです。 目的遺伝子である植物のフィトクロムなどでは希釈系列は正しく検量線を描き、100%前後の増幅効率を示し、NTCは増幅しません。 しかし、ハウスキーピング遺伝子について、Elongation factorでは増幅効率がマイナスになり、TATAbox binding proteinでは数万%という極めて異常なものとなってしまい、また、NTCも増幅されるという結果になります。 コンタミの可能性を考えてプライマーを新しくし、ミリQ水とSYBRも新しくしましたがそれでもハウスキーピング遺伝子の2つについては希釈系列が整わず、NTCが現れてしまいます。 この現象についてラボ内にエアロゾルが存在する、cDNAの溶液が跳ねてコンタミしているなどを考えましたが目的遺伝子のNTCについては増幅が見られないため原因はこれではないと考えています。 仮にエアロゾルが舞っていたとして、ハウスキーピングだけを増幅するようにコンタミするか。または反応液を調整するチューブが駄目なのか（ミリQを入れてボルテックスするとnanodropでなぜかDNAが検出される）。ハウスキーピングの発現が多すぎて正確に検出できていないのか。 などと考えています。 リアルタイムPCRの不具合について対処法を心得ていないのでどうか助言をいただければと思います。

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