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(無題) 削除/引用 No.8037-3 - 2019/07/01 (月) 09:35:05 - HXT TM先生 早速ご意見いただきまして、ありがとうございます。 心から感謝しています。 早速CD41の陽性と陰性の分画をバックゲーティングしてみました。 すると、TM先生のご指摘の通り、FSCとSSCは変わりませんでした。 これらのことからCD41の染色は巨核球細胞に限らず、他の細胞にも出ているようです。 そして私のデータでは32Nに一つピークがありまして、2Nと4Nよりは低かったです。 以上のことから、TM先生のご指摘の通り、非巨核球細胞が混じっているため、2Nと4Nの底上げが起きているのだと考えられます。また、自分が32Nだと思っていたピークも16Nだとすれば、私の考え方の根本から正さなければならなさそうです。 まさか巨核球細胞を扱われる方から直接アドバイスが頂けるとは思っていませんでした。 TM先生はどんなバッファーを使って骨髄細胞を調製しておられますか？ 私は1％BSA+1 mM EDTA in HBSS bufferを使っています。 溶血はさせていませんがした方がいいでしょうか...？ ACKバッファーという塩化アンモニウムベースの溶解バッファーは持っています。 細胞調製バッファーの組成と溶血の必要性の有無についてお伺いできますと幸いです。 ヘキストは等間隔で並んではいそうです。 ただ、10年前以上の試薬なので、試薬に問題がないことは否定はできないですね...。 ログで良かったのですね。ここのフォーラムも前の方にもログが進められていたので、ログで良かったのだとさきほど思っていました。また、マウスでは16Nにピークが認められるとは意識していませんでしたので、今日また行う際に注意深くその辺を観察してみます。 血小板は他の細胞にベタベタ付く印象を私も持っていますが、やはりリネージマーカー（CD3、Ly6G、B220、CD11b）などを併用し、巨核球以外のリネージを除外した方が綺麗な結果は出やすいものでしょうか？ 引き続きコメントをいただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.8037-2 - 2019/07/01 (月) 06:08:39 - TM 1. WTマウス骨髄のCD41陽性細胞のFSC/SSCを、陰性細胞と比べて下さい。もし変わらなければ、CD41染色がうまくいってないと考えられます。また、WTマウス骨髄CD41陽性細胞の2N/4Nのピークと16Nのピークを比べて下さい。2N/4Nが16Nより高い場合も、CD41染色がうまくいってない（巨核球以外の細胞がかなり混じっている）と考えられます。そのような場合は、血小板が付着した好中球を拾ってしまっている可能性を考えます。 Hoechstのピークが等間隔で並ばない（ログスケールで）場合は、Hoechst染色がうまく行っていない可能性もあります。 2. 巨核球の場合、ploidyのレンジが広いのでログの方が無難です。WTでは16Nがピークで、主に8N-32Nに分布するので、この辺りに合わせたリニアでも行けるとは思いますが、遺伝子改変マウスではどう出るか分からないので、ログで広くカバーしておいた方が良いと思います。

DNAの2N、4N、多核解析について 削除/引用 No.8037-1 - 2019/07/01 (月) 05:07:52 - HXT いつも勉強させてもらっています。 この度、ある遺伝子改変マウスにおける骨髄細胞にて、巨核球細胞の核のDNA量を比較することになりました。 骨髄をフラッシュし、CD41抗体で染め上げ、その細胞の中のDNA量をWTとノックアウトマウスとで比較しましょうというのが計画です。 巨核球細胞は64Nや128NのDNA量を示すことも多々あり、そのDNA量をhoechst33342で染めることにしました。 hoechst33342の濃度を五段階ほど振り、染色の10分後に洗浄を行い解析しました。 アイソタイプ抗体では見られないミークがCD41で染め上げたものには認められたので、CD41の巨核球は綺麗に特異的に捉えたらています。 ところがhoechst33342の染色をCD41陽性と陰性とで比較するとhoechst33342の染まり方に差が認められませんでした。 つまり、 異なるDNA量を意味するいくつかピークは認められるものの、それがCD41陰性の非巨核球細胞の骨髄細胞の中にも認められるようです。polyploidyは巨核球細胞や骨格筋細胞でしか認められないにも関わらずです。 そこで質問させてください。 1. CD41陽性にゲートをかけるかけないに関わらず、hoechst33342の染まり方に差が認められないのはなせでしょうか？ 2. hoechst33342の検出用のフィルターはログのままでもいいのでしょうか？論文ではリニアも使われていました。私もリニアで試してみましたが、変わりませんでした。 アドバイスをいただけますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

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