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(無題) 削除/引用 No.8035-7 - 2019/07/06 (土) 20:29:38 - taka おおさん、ご参考までさん、cDNAさん、あいみょんさん 皆さん、親切丁寧な回答を有難うございます。返信が遅くなり大変申し訳ありません。 　TOPOクローニングはクローニング効率の点でメリットがあること 　ngオーダーで切り出せていればライゲーション可能であること 　PCRの条件設定、特にNested PCRやタッチダウンPCRが有効であること がよく理解できました。 まずは今の条件で回収できる産物でライゲーションを試み、それで入っていなければNested PCRを考えてみようかと思っています。有難うございました。また何かあれば相談させてください。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.8035-6 - 2019/07/01 (月) 11:13:15 - あいみょん 切り出せるくらいのDNA量があれば、TOPOじゃなくても十分な量だと思います。 TOPOは、とても入りやすいので多少量が少なくても効率でカバーしてくれる印象はありますが、TOPOでも改善しないような気が何となくします。 意外と実施していた方法で、数打ちゃ取れると思います。 それで取れなきゃ、量とは違う問題だと思います。

(無題) 削除/引用 No.8035-5 - 2019/06/29 (土) 09:48:28 - おお 少量というのがやはりきになるので再度書き込みします。 エチブロでバンドが見れて切り出ししていたならｎｇオーダーありますよね。少なくて困るほどの量じゃないと思いますけど、、そこが不思議なんです。

(無題) 削除/引用 No.8035-4 - 2019/06/29 (土) 08:54:10 - cDNA TOPOベクターを既に持っていたり、購入できる状態なら、TOPOの欠点というものは別に無いと思います。 in fusionは要求されるDNA量が多いので、PCRで量が取れない時には向いていないと感じています。 コロニーの出る数で言うと、これまでの経験ではpGEM-Tは多いですね。もちろんA付加が必要ですが。なんで4塩基突出の制限酵素サイトでのクローニングよりも出るコロニー数が多いのか昔から疑問なのですが、なぜか多いです。(当社比) ゲノムからだと、とりあえずでも増やせる断片であればNestedはかなり効果的だと思いますが、既にやっていたらすみません。

(無題) 削除/引用 No.8035-3 - 2019/06/28 (金) 23:56:07 - ご参考まで お金はかかりますが、 増えるならin fudionクローニング（お安くするならsliceクローニング）で一発で入れてしまうのはどうでしょうか。 ゲノムpcrは経験的に kapa hifi hot start ＋ final 1Mベタイン、アニーリング 60℃でどうにかなっています。

(無題) 削除/引用 No.8035-2 - 2019/06/28 (金) 21:44:42 - おお �@少量のPCR産物からクローニングが可能 昔からあるLigationでも典型的なプロトコールにある量より少なくてもうまくいきます。RIでラベルして、PAGEで出てきたバンドの部分を切り出してLigationでクローンを拾ったっていう論文はよく見かけたものです。 そういうLigationは典型的なプロトコールで１０００個ぐらいクローンが拾える事を考えると、インサートの量が１００分の１でもそんなに苦労しないはず。 ただし、系が理想に近い状態でやるためにしっかり条件を整えるという点で難しさがあるとおもう。 TOPOの場合はそういう点でいくらかメリットがあるかもしれません。 �ATOPOベクターのprimerを用いて断片全長のシークエンスが可能 シークエンスはどんなプラスミドに入れても可能ですが、、、 それよりPCRしてもちゃんとした量が取れないところが危ういところと思われます。 タッチダウンやNested、ベタインなどの添加物などいくらか条件を試してみたほうがよろしいのではないかと。 切り出したバンドをもう一度PCRするとちゃんと増えますか？

TOPOクローニングのメリット 削除/引用 No.8035-1 - 2019/06/28 (金) 19:22:41 - taka 培養細胞からとったゲノムを鋳型に、ある特定の断片（1Kbpほど）をPCRで増幅し、別のプラスミドにクローニングする実験を行っています。PCRの条件を振ることで、（複数の非特異的バンドはあるものの）期待した高さにバンドも確認できたので切り出してみましたが、次のライゲーションに足る量が取れず困っています。 PCR産物を一旦TOPOクローニングすればよいと聞いたのですが、経験がありません。この様なケースでTOPOクローニングを行うメリットとしては �@少量のPCR産物からクローニングが可能 �ATOPOベクターのprimerを用いて断片全長のシークエンスが可能 という認識で間違いないでしょうか？よろしくお願いします。

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