BioTechnicalフォーラム [Tag抗体を使用したWBのノンスペ]

Tag抗体を使用したWBのノンスペ

No.8034-TOPIC - 2019/06/28 (金) 13:34:40 - nm

Flag-tag付き遺伝子をノックインしたマウスから組織をとり、WBを行なっています。
Flag抗体で検出しているのですが、目的バンドに加えて、レーンの上から下まで無数のノンスペが
出て、なんだこれはという状況です。
ちなみに、コントロールとして使っているWT（flagなし）でも、Flag抗体で同様にノンスペが出ます。

Flagをつけている遺伝子は、よく知られているもので、バリアントがあるようなものではないです。
この遺伝子に対する抗体では、目的サイズ付近に単一バンドが出ます。

同じような状況を経験された or 何か改善点のアドバイスをいただけないかと思い、
ご相談しました。
Flag抗体は、Flag-M2で、一般的なものです。
原因が、抗体かそれ以外かわからないので、抗体を買う前に考えられる改善点を検討しようか
と思っているのですが（Lysis bufferのdetergent等？）、何か他に
変えてみると良さそうな点はあるでしょうか？
　

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No.8034-10 - 2019/07/01 (月) 18:02:55 - nm

皆様、大変参考になるご意見ありがとうございました。

今までマウス抗体ーマウスサンプルで問題が出たことがなかったので
抗体が問題である可能性を、それほど考えていなかったのですが
抗体が問題の可能性が高いですね・・。

IgGを拾っているにしては、ノンスペバンドの数が多すぎるようにも
思うのですが、
ご指摘があったように
抗FLAG M2抗体は従来の結合力が比較的高い製品（F3165）
まさにこれを使用しています。
わざわざ特異性の高い製品を別売りするということは、特異性がそもそも低い可能性もあるかもしれませんね。

とりあえず、週末、試供品らしきrabbit anti-Flag polyを発掘したので
そちらを使用してみたいと思います。
二次抗体は、サブクラス特異的ではないものなのですが、
今までラボ内で、別のマウス一次抗体ーマウスサンプルのWBにおいて問題が
出たという話を聞かないので、とりあえず一次抗体から検討したいと考えています。

ありがとうございました。

(無題)

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No.8034-9 - 2019/06/29 (土) 08:36:23 - AP

一次抗体はいいとして二次抗体はどんなのを使っているのかな？
サブクラス(IgG1)特異的抗体あるいは抗Fab抗体何かを使うといいかもしれない。

(無題)

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No.8034-8 - 2019/06/29 (土) 07:39:40 - mom

>[Re:6] おおさんは書きました :
> >抗FLAG M2抗体は従来の結合力が比較的高い製品（F3165）と特異性が比較的高いアフィニティ精製済みの製品
>
> モノクロなのにどこからこの差が来るのか不思議ですね。精製してないと夾雑するIgGがあるという話なんでしょうかね。

mAb調製に腹水を利用していて、マウス由来IgGが混入していたのではないかと推測します。あるいは、ハイブリドーマの中には（ミエローマ由来の）微量のL鎖遺伝子を発現しているものがあるのでキメラ抗体が混入しているのかもしれません。

(無題)

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No.8034-7 - 2019/06/29 (土) 05:42:14 - TM

興味深いのですが、マウス組織のウエスタンで混入IgGを二次抗体で検出してしまう場合、サイズはどうなるのでしょう？　無数のバンドというのはちょっと違う気がするのですが。

マウスの腸や肺の組織からのサンプルをウエスタンして、マウスモノクロの一次抗体を当てたりしてますが、組織IgG由来と思われるノンスペが問題になった経験がないです。二次抗体の質によって異なる結果になったりするのでしょうか？　組織の免染ではマウスオンマウスの問題が結構頻繁に経験されるのに、ウエスタンではそのような経験が無いことに気づいて、ちょっと不思議な感じもします。

マウスオンマウスが問題なのであれば、HRPを直接conjugateしたM2抗体とか、native IgGだけを検出する二次抗体とか、対策はありそうですね。

(無題)

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No.8034-6 - 2019/06/29 (土) 02:33:10 - おお

>抗FLAG M2抗体は従来の結合力が比較的高い製品（F3165）と特異性が比較的高いアフィニティ精製済みの製品

モノクロなのにどこからこの差が来るのか不思議ですね。精製してないと夾雑するIgGがあるという話なんでしょうかね。

加えますが、もしIgGなど避けたい場合はプライマリーCultureにしてからWBと言う手も。B cell系とかだと意味がないかもしれませんけど。

(無題)

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No.8034-5 - 2019/06/28 (金) 16:31:11 - mom

www.sigmaaldrich.com/japan/lifescience/antibody/flag_intro.html
抗FLAG M2抗体は従来の結合力が比較的高い製品（F3165）と特異性が比較的高いアフィニティ精製済みの製品（F1804）をご用意しています。

(無題)

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No.8034-4 - 2019/06/28 (金) 14:44:06 - み

一次抗体なし、二次抗体のみで検出して同様になるか確かめればどちらの抗体の問題なのか判明するかも。

(無題)

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No.8034-3 - 2019/06/28 (金) 14:34:54 - 遠さく推し

マウスオンマウスが原因でしょう。