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フローサイトメトイーでの蛍光補正についてのご相談 トピック削除
No.8032-TOPIC - 2019/06/28 (金) 00:56:19 - 住野
ヘキスト33342とPacific blue-anti-CD45を使って
FACS Celestaにて細胞周期の解析をしたいのですが、

補正の仕方で質問があります。

FACS Celestaには特別ヘキスト33342のチャンネルがありませんが、
デフォルトでついているBV510というチャンネルをヘキスト検出用にして、Pacific blueはBV421というデフォルトのチャンネルで蛍光補正ができるのではないかと考えていますが、実際それは可能でしょうか?
 
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No.8032-8 - 2019/06/28 (金) 12:23:28 - asan

最近の機種は機械の名前が同じでも光源とフィルターの組みあわせで全く違うので、
使えるかどうかはそれらを考えて自分の使いたい機種の設定で問題ないか、共染色が可能かどうか
を確認しなくては意味がないです。

例えばPEなどの励起はblueレーザーでやることが多いですが、yellow greenレーザーがあればそちらで
励起することが多いため、その場合同じAriaやCantoなどの機種名でも全く挙動が違ってきます。

http://www.bdbiosciences.com/jp/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp

を使って漏れ込みとか組み合わせが問題ないかは検証できます。
チャンネル名はあくまでセッティングでそのチャンネルと励起波長を使う時にそれを使うと指定してるだけの場合が多いので、名前がないから使えないというわけでもありません。

逆に言えば、よくわかってないヒトが勝手に設定を変えるとこの辺がごちゃごちゃに指定されてしまうことにもなるので注意が必要です。

(無題) 削除/引用
No.8032-7 - 2019/06/28 (金) 09:48:28 - 住野
SEさん、ありがとうございます!
来週にも試薬が届くので試してみます!

(無題) 削除/引用
No.8032-6 - 2019/06/28 (金) 09:19:09 - SE
そういう組み合わせで実験をしたことがあるわけではないのですが、私の経験上はヘキストはチャンネルをいくらずらしても明るいので、ヘキストを使った時はUV・バイオレットレーザーの他の色素は使わない様にしています。
いずれにしろまずはやってみるしかないと思いますが、うまくいったら教えてください。

(無題) 削除/引用
No.8032-4 - 2019/06/28 (金) 06:21:32 - 住野
おお先生

私の質問は、ヘキスト33342とPacificBlueで共染色する際のチャンネルのことなのですが、どちらもデフォルトではCelestaにはありません。

ただPacificBlueがBV421で検出可能なこと、ヘキスト33342がBV421とBV510で検出可能なことから、

PacificBlueをBV421で補正、ヘキスト33342をBV510で補正をかければ行けるのではないか、と頭の中では考えていますが、こういった方法が本来取るべき対応かどうかがわかりません。(もちろんCD45抗体なんて他の蛍光のものが安くは売られているでしょうが、今あるもので対応を考えています。)

今後は更に蛍光を増やし、

ヘキスト33342、PacificBlue、PE、PerCP-Cy5.5、Alexa488、APCで挑みます。
その前にヘキスト33342とPacificBlueの検出の工夫についてご意見いただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用
No.8032-3 - 2019/06/28 (金) 04:48:34 - おお
>[Re:2] おおさんは書きました :

> >Pacific blueはBV421
> これもかなり外れているような気がするけど、、、

あ、失礼これはいいみたいフィルターはバンドパスじゃないのかも

(無題) 削除/引用
No.8032-2 - 2019/06/28 (金) 04:46:34 - おお
Hoechst 33342 Excitation/Emission (nm) 350/461

>Pacific blueはBV421
これもかなり外れているような気がするけど、、、

フローサイトメトイーでの蛍光補正についてのご相談 削除/引用
No.8032-1 - 2019/06/28 (金) 00:56:19 - 住野
ヘキスト33342とPacific blue-anti-CD45を使って
FACS Celestaにて細胞周期の解析をしたいのですが、

補正の仕方で質問があります。

FACS Celestaには特別ヘキスト33342のチャンネルがありませんが、
デフォルトでついているBV510というチャンネルをヘキスト検出用にして、Pacific blueはBV421というデフォルトのチャンネルで蛍光補正ができるのではないかと考えていますが、実際それは可能でしょうか?

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