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(無題) 削除/引用 No.8022-20 - 2019/07/02 (火) 12:36:51 - mom 本題から外れますが、タンパク実験用ではHEPESが好みです。

(無題) 削除/引用 No.8022-19 - 2019/07/02 (火) 10:49:21 - おお あ、そうでした。修正ありがとうございました。でもバッファー能が結構やられるのがやはり個人的にはいやで、、、そこは絶対TRISをバッファーとして選択したくないという個人的な好みみたいなものです。

(無題) 削除/引用 No.8022-18 - 2019/07/02 (火) 10:42:51 - mom 10% NBF=10%ホルマリン＝約4% ホルムアルデヒド＝約１M ホルムアルデヒドですよね？ 経験上トラブルになったことはないのですが、おおさんの懸念通りタンパクによるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8022-15 - 2019/07/02 (火) 09:51:01 - おお 10%NBFで、３M以上のアルデヒド。１０ul残ったとして、１ml TBS加えると１００倍希釈。だから３０mM以上がそのTBS溶液にあるという計算ですけど。 TRITONで透過処理するならそのときに一度置換するという事でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8022-14 - 2019/07/02 (火) 09:49:34 - mom おおさん、計算間違いしていますよ。 でも良い指摘なので、事前にpH試験紙で（大きな）pHの変化がないことを確かめたら安心かと。

(無題) 削除/引用 No.8022-12 - 2019/07/01 (月) 23:24:50 - おお >[Re:11] momさんは書きました : > >[Re:10] おおさんは書きました : > > 透過処理後にということですね１％ホルムアルデヒドでも３００mM以上ですからちょっとおおいなと、、、 > > 遠心して大部分の固定液は取り除き、1mL程度のTBSを加え、さらにその操作を2回繰り返しますので、問題ありません。 > 最終的にTrisは大過剰になるのでそういう意味ではいいと思いますが、最初の遠心で除いたときに１０ｕlチューブに残っていれば１mlにするとして百分の１程度の希釈、フォルムアルデヒドは３３mMほど。バッファーのトリスの殆どが反応して無効になってしまう可能性があります。この時点でpHが安定している保証がなくなるというのが懸念なんですが。HClでpH調整をしているだろうからTrisが半分でも減ってしまうとかなり酸性に偏ってしまうのではと。迅速にやれば反応を最小限に抑えられるのかもしれませんけど、どの程度が許容範囲か目安も提示できないし。

(無題) 削除/引用 No.8022-11 - 2019/06/30 (日) 08:18:54 - mom >[Re:10] おおさんは書きました : > 透過処理後にということですね１％ホルムアルデヒドでも３００mM以上ですからちょっとおおいなと、、、 遠心して大部分の固定液は取り除き、1mL程度のTBSを加え、さらにその操作を2回繰り返しますので、問題ありません。

(無題) 削除/引用 No.8022-10 - 2019/06/28 (金) 23:49:04 - おお >固定＞+Triton＞遠心＞TBS+BSA＞遠心＞TBS+BSA >のつもりでした。これなら、Trisは過剰量のハズです。 透過処理後にということですね１％ホルムアルデヒドでも３００mM以上ですからちょっとおおいなと、、、

(無題) 削除/引用 No.8022-9 - 2019/06/27 (木) 10:10:54 - mom > すんません。Trisはホルマリンと反応するのでバッファーとして働かないんですよ。 知っています。tween20もホルマリンを中和できるようです（反応式は分かりません。） 固定後、液交換しますよね？説明仕方が悪く申し訳ない。 固定＞遠心＞TBS+BSA+Triton＞遠心＞TBS+BSA＞遠心＞TBS+BSA あるいは、 固定＞+Triton＞遠心＞TBS+BSA＞遠心＞TBS+BSA のつもりでした。これなら、Trisは過剰量のハズです。

(無題) 削除/引用 No.8022-7 - 2019/06/27 (木) 00:37:19 - おお >膜透過処理および洗浄にTBS(25-50mM TrisHCl, 150mM NaCl)＋BSAを使えば良いとおもいます。 すんません。Trisはホルマリンと反応するのでバッファーとして働かないんですよ。PBSにTris混ぜたほうがいい。

(無題) 削除/引用 No.8022-6 - 2019/06/27 (木) 00:01:30 - FACS乙 抗体の非特異的反応とはちがうけど、過度のホルマリン固定は自家蛍光の原因になることがあるというのは実験書で読んだ事ある。蛋白質への化学修飾の結果、いろんな人工物を生じる中に蛍光物質ができるとかそんな感じだったと思う。そういうのがBG上げてることはあるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.8022-5 - 2019/06/26 (水) 09:47:50 - mom 膜透過処理および洗浄にTBS(25-50mM TrisHCl, 150mM NaCl)＋BSAを使えば良いとおもいます。 特別なブロッキング（時間）は不要なことも多いです（洗浄中の5分程度で十分）が、バックが高いなら３０分程度に伸ばしてみてください。 TrisイオンはUV吸収があるので、目的によっては最終的に（抗体反応＋洗浄等で）PBSに置換してください。

(無題) 削除/引用 No.8022-4 - 2019/06/26 (水) 00:09:22 - おお ホルマリンが残るとそれは架橋剤になるからあちこちに抗体が接触した際に架橋されてしまう可能性はありますね。ただBSAはそれを中和するでしょうけど量としてどうなんだろう。ラフな計算はしてみてもいいと思う。十分量あるならホルマリンの濃度が減った２回目のときにでも４度で２、３０十分置いてBSAと反応させてしまえばいいのかもしれない。 アルデヒドの中和には場合によってはTrisやグリシンを使うことがある。バッファーとしてじゃなく中和剤として。だからバッファーで中和しようとするとバッファー能がなくなってします。 机上の空論ということで。

(無題) 削除/引用 No.8022-3 - 2019/06/25 (火) 20:17:09 - 北川 固定液組成は10%NBFです。 その後、膜透過処理を連続して行い、洗浄は1%BSAの入ったPBSで5倍希釈し遠心。上清を捨て、その後ペレットに1mlの洗浄液を加え再度遠心をもって洗浄としました。 ブロッキングの時間は特にもうけていません。 洗浄後すぐに抗体を加えていました。 確かにブロッキングは設けた方が良さそうですね… 1%BSA in PBSでブロッキングを1時間ほどすればいいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8022-2 - 2019/06/25 (火) 09:58:50 - mom 固定液組成は何ですか？ 洗浄液組成は何ですか？ ブロッキングは行いますか？

固定後の洗浄が甘いと抗体のバックグラウンドは高くなりますか？ 削除/引用 No.8022-1 - 2019/06/25 (火) 09:49:38 - 北川 非常に微量な細胞数のサンプルで細胞内フローサイトを行わねばならないのですが、固定後の洗浄を一度もしくは二度しただけでは、固定液が残存し、それが抗体の非特異的な染色の原因になり得ますか？ 全ての操作はエッペンチューブ内で行なっています。

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