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(無題) 削除/引用 No.8009-14 - 2019/07/12 (金) 15:02:10 - MEF mp様 ありがとうございます。 試してみます。

(無題) 削除/引用 No.8009-13 - 2019/07/10 (水) 09:08:23 - mp 一度、不死化したMEFかNIH-3T3などに感染させてみたらいかがでしょう。それでも光らなければやっぱりウイルス側の問題ということになるでしょうし、もし光るのであれば、使っているprimary MEFの感染効率が極端に低い可能性が出てくるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.8009-12 - 2019/07/09 (火) 14:09:52 - MEF MEFの状態についてご指摘頂いてから、新しくMEFを樹立し直しました。 P0の細胞を起こして、2日間培養し、継代して翌日にレンチウイルスの感染に用いました。2日間で細胞が増えることは確認できました。 しかしやはりレンチウイルスが感染できていないのか、感染しても発現が弱いのか、ウイルス感染後2日経っても蛍光は検察できませんでした。 MEFは293Tに比べて極端に感染しにくいのでしょうか？ MEFや293Tでレンチウイルスのタイターを測ったことがある方は、濃縮前や濃縮後にどれぐらいのタイターを得られていますか？ これまでは10cm皿1枚で作成したウイルスを濃縮して用いていますが、10枚分くらいに増やしてみるというのは意味はあるのでしょうか？ 1枚分で全く感染していない状態で、それを10倍にしても意味がないようにも思えます。 最悪プロモーターを変えることも考えてはいますが、時間がかかると思うので、それ以外になにかすぐに取れる対策があれば教えて頂きたいです。 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.8009-11 - 2019/06/24 (月) 13:48:20 - MEF TM様　おお様 細胞の起こしたては感染実験には向いていないかもしれないのですね。 一応細胞は見た感じでは増えてはいて、死んだ細胞がたくさん浮いているということもないです。ただ3.5cm皿に3x10^5播種していて、細胞がごった返していてはっきりとはわからないですが、形態があまりきれいではない気がします。 なるべく継代数の少ない状態で使いたかったのでこのプロトコルで行っていましたが、ちゃんと増殖するのを確認してから行ってみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.8009-10 - 2019/06/23 (日) 08:10:43 - おお >凍結されたP1のMEFを起こし、翌日に感染するプロトコール あ、これに気が付かなかった。調子が悪いとあまり実験にならないし、増え方が鈍いと発現量も弱いような気がしている。

(無題) 削除/引用 No.8009-9 - 2019/06/23 (日) 01:14:16 - TM 凍結されたP1のMEFを起こし、翌日に感染するプロトコールのようですが、細胞の状態は大丈夫ですか？　自分なら、数日培養して、増殖を確認してから感染実験を始めると思います。プライマリーのMEFの場合は数回継代すると増殖が止まるので、なるべく早く感染実験を始めたい気持ちも分かりますけどね。

(無題) 削除/引用 No.8009-8 - 2019/06/22 (土) 21:39:18 - MEF 皆様ありがとうございます mp様 CMVがダメそうな場合EFに変えることも考えたいと思います み様 私もその論文に辿り着いてさらっと見ましたが、 BL6のMEFならCMVは使えるみたいですね おお様 タイターは293tを用いて測定したところ、濃縮前で6.6x10^5でした 濃縮後についてはまだ測定できていません

(無題) 削除/引用 No.8009-7 - 2019/06/22 (土) 04:40:01 - おお 293tはTransfectionはしたけど、直接ウイルスのInfectionはしてないように見えますね。タイターは見積もったんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8009-6 - 2019/06/21 (金) 16:58:39 - み https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0010611

(無題) 削除/引用 No.8009-5 - 2019/06/21 (金) 15:23:49 - mp MEFとCMVの相性は、発現はするとは思うけど経験上あまり良くない気がする。EFの方がベターではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.8009-4 - 2019/06/21 (金) 15:15:09 - MEF み様　おお様 ありがとうございます。 確かに293tには感染していても、MEFには感染していない可能性はあると思います。 レンチウイルスはpoly-l-lysineコートした10cm皿に、293tを6x10^6播種し、翌日にトランスフェクションを行っています。 トランスフェクション効率はトランスフェクション翌日の蛍光でほぼ100%でした。トランスフェクション翌日に10uMのフォルスコリンを含んだ培地に交換した後48時間培養しました。その後培地を回収し、0.45uMフィルターを通して、amicon ultra 15 100Kで限外濾過 (5,000xg 4℃ 45分) を行い、濃縮されたウイルス液全量に培地を1mlになるように加えて、polybreneを終濃度8ug/mlで加えて感染に用いました。 プラスミドは理研から購入したpCAG-HIVgp pCMV-VSV-G-RSV-Rev CSIV-TRE-RfA-CMV-KTを用いています。 この蛍光を使ってこれからタイターを測定したいので、発現量が低く検出できないとなると困ってしまいます。 ウイルス作製に関してどのように改善すればよいのか、今のところ分からないです。

(無題) 削除/引用 No.8009-3 - 2019/06/21 (金) 14:12:30 - おお MEFならCMVで発現しそうな気がするので、感染効率とかの問題かもと思うのだけど。レンチウイルスはどのようにして作られたのですか？商品であればどこのどのシステムですか？

(無題) 削除/引用 No.8009-2 - 2019/06/21 (金) 14:04:33 - み MEFに感染していない可能性は？ HEK293とMEFは違うからね。 感染していたとして発現レベルが低く蛍光観察では検出限界以下だった可能性。 WesternやIP-westernなど他の方法で検証。

MEFでのプロモーター活性 削除/引用 No.8009-1 - 2019/06/21 (金) 11:24:55 - MEF MEFにレンチウイルスを用いて遺伝子導入を行っています。 用いているトランスファーベクターはMEFで機能することが報告されています。 しかし実際にMEFに濃縮したウイルスを感染させると、このベクターに載った蛍光タンパク質の蛍光を、蛍光顕微鏡で全く観察できませんでした。 この濃縮したウイルスを293tに感染させると、十分量感染し、蛍光が観察できます。なのでウイルス側には問題はなく、細胞の問題ではないかと考えています。 蛍光タンパク質はCMVプロモーターに制御されているのですが、MEFが由来する系統によって、CMVプロモーターが使えないということはあるのでしょうか？ 報告されている論文で用いられているマウスの系統は不明ですが、私はICR由来のP1のMEFを起こして計数して播種し、翌日感染に用いています。 どなたかご存じでしたら教えて頂きたいです。 宜しくお願いします。

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