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(無題) 削除/引用 No.8-7 - 2012/01/09 (月) 10:26:44 - あ！ サンプル処理によるinternal control自体の変化の可能性はないでしょうか。GAPDHはだめだが、actinでは揃うとか。

(無題) 削除/引用 No.8-6 - 2012/01/08 (日) 15:26:09 - ABZO nanodropって紫外部吸収かな？。ならそれでウェスタンときの蛋白質濃度決めるのはまずいな、ていうかふつううちらはしないな。そのへんの波長だといろんなものが影響しまくるから(280nmもかなりそうだけど210nmは特に顕著）。核酸とか血とか界面活性剤とか生体色素とか,　溶け残りの微細なゴミとか。そういうのの混じり具合で値はどうにでも動くから。あと蛋白質の変性具合でも変わるとかがっこで習った、なんとか効果とかいうやつ。あとRIPAとか使ってるとき、トライトンとかその辺の波長だとヤバくないかな。複数のサンプルを同じように調製して定量値がばらつきすぎる時はウェスタンする前に何か変な事がおきてないか、よく確認したほうががいい。時間と労力を無駄にしないために。 紫外部280nmも目的によっては、たとえばクロマトとかで蛋白質の溶出の様子をモニターする時とかは非常に有用な方法だけどね。

(無題) 削除/引用 No.8-5 - 2012/01/07 (土) 22:05:31 - 月詠 基本的には、ブラッドフォード法などの簡易タンパク定量法でタンパク濃度を測定するべきだと思います その上で、各試料間のタンパク量のバラツキをより正確に調整するのであれば、わたしだったら、最初にプレランして内在性対照のバンドの濃さを半定量して、それを基準に試料のタンパク濃度を（希釈で）再調整して、再度ＳＤＳ‐ＰＡＧＥすると思います 再調整は、内在対照のバンドの積算値が、たとえば、 試料１　１００００ 試料２　１２０００ 試料３　１５０００ だったとしたら、試料１を基準にして、試料２は1.2倍に、試料３は1.5倍に希釈するといった具合です（試料液量が全部で100μlだったら、試料２は20μl足して120μlにする）

(無題) 削除/引用 No.8-4 - 2012/01/07 (土) 19:03:33 - KY nanodropで細胞ライセーとのタンパク濃度を測ることはかなり無理があると思います。ライセートにはタンパク以外にも核酸があるので、タンパク質のみを純粋に測れるわけありません。 ちゃんとBCAやbradfordをやりましょう

そろえるのは難しくて 削除/引用 No.8-3 - 2012/01/06 (金) 11:39:09 - ema 基本的にODであたりはつけれますが正確に同量のせるのは難しいです。 nanodropを使っているという事で何を測定しているのでしょう。単に280nmで測定する場合、RIPAに限らず全ての蛋白抽出液は色々なものが入っているので相当濃い抽出（ほぼないです）でないと、同じO.D値というのは同じ蛋白抽出量をのせて実験できるということではありません。（RIPA等ににBSA入れてSTD線の予備実験すると判ると思います） エンハンスの為にBradford,Lowry,BCAがnanodropにもあると思いますが、実体験からはやっぱり薄くて判らなかったからだいだいでとか、Westernでの定量だとずれて前実験を参考に修正量を流すというようにしていました。

(無題) 削除/引用 No.8-2 - 2012/01/05 (木) 22:05:28 - qq ＞抽出液はRIPAを使っています。 ＞RIPAってnano dropでは使えないんでしょうか？ 事実上、使えないと思いますが、RIPAだけをナノドロップで測定していないのですか？

WBでのタンパク量の揃え方 削除/引用 No.8-1 - 2012/01/05 (木) 21:57:27 - 初心者 いつもお世話になっております。 WBでタンパク濃度を揃えるために、毎回nano dropで測定しているのですが、 いざ泳動してみるとinternalの濃さが全然違います。 抽出液はRIPAを使っています。 RIPAってnano dropでは使えないんでしょうか？

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