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(無題) 削除/引用 No.7999-13 - 2019/07/11 (木) 18:23:17 - 世界観 私も約160kDaのリコンビナントタンパク質でまったく同様の症状が起きています。 早く精製して次に進みたいのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.7999-12 - 2019/06/20 (木) 10:40:29 - あいみょん おおさん、ご丁寧な回答ありがとうございます。 超音波処理で、ソニケーションBufferには、300 mM NaClが 含むように実験を行っていますが、より濃くしたほうがよいと いうことでしょうか？ カラム許容量が最大値の塩濃度くらい加えてみるってことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7999-11 - 2019/06/19 (水) 23:53:08 - おお >オリゴマーとか形成して末端が隠れるとかでしょうかね. こういう場合は塩濃度を上げたりしてモノマーの状態にしてやれば可能性があると思います。

(無題) 削除/引用 No.7999-10 - 2019/06/19 (水) 23:50:37 - おお オリゴマーとか形成して末端が隠れるとかでしょうかね. 可溶性画分にきていても数分子がアグった状態で末端が隠れているとかいうこともまあまああるようです。そういうものは不溶画分にあるような蛋白と一緒で取るべき構造は取ってないかもしれません。 またそういうことが起こるのは結構強めの物理的な処理をしたときでフレンチプレスとか超音波処理とかでしょうかね。ビーズでガシャガシャやるのも程度によるかもしれませんが起こるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7999-9 - 2019/06/19 (水) 13:28:22 - おお うまくいくかわどうか分かりませんがやれそうな事は、 変性作用があまりない界面活性剤をつかう（つかってないなら）。 塩濃度を調製してみる。 ｐHをもう少しあげてみる。 そのHisタグのカラムへの相互作用が弱いため他のものとの競合で負けているなら、透析や他のカラムなどでそ精製をかます。 ２Mぐらいの尿素であれば変性作用が弱いので非変性で抽出できるという話もあり、具体的なプロトコールも見た事があります。 LiClなどそんなに強くないカオトロピック作用を持つものをつかう。

(無題) 削除/引用 No.7999-8 - 2019/06/19 (水) 12:55:37 - あいみょん APさん、winter-8さん返信ありがとうございます。 可溶性画分から回収したい理由として、巻き戻しの過程が 難航しそうと考えているためです。 やはり、タグの変更を考えてみたいと思います。 ありがとうございます。 1日ほど皆さんの意見をお待ちして、このトピックは解決とさせていただきます。皆さん、その他アドバイスがありましたらお待ちしてます。 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.7999-7 - 2019/06/19 (水) 12:04:34 - WInter-8 非常によくある話だと思います。 この場合、私はタグを変えています。StrepやGSTタグとかはいかがでしょうか。 サンプルに依存するとは思うのですが、立体構造上はタグが埋もれているはずがないのにカラムにつかないこともあるんですよね。His-tagと相性が悪い（positive chargeの影響？）可能性もあると思います。

(無題) 削除/引用 No.7999-6 - 2019/06/19 (水) 11:50:10 - AP 一旦変性条件にするのがどうしても不都合なのであれば、リンカー配列を入れるとか別のタグにするとか、設計からやり直す必要があるんのでは、

(無題) 削除/引用 No.7999-5 - 2019/06/19 (水) 11:44:34 - AP いえいえ、可溶性画分にあってもタグを露出させるために変性剤を入れることもあるっちゅう話です。変性条件で付くっていうことはまさそれ、じゃないですか。 https://www.takarabio.com/about/bioview-blog/tips-and-troubleshooting/when-your-his-tagged-constructs-dont-bind

(無題) 削除/引用 No.7999-4 - 2019/06/19 (水) 11:12:20 - あいみょん みなさん返信ありがとうございます。 >>おおさん CBBでは一応検出できるレベルでは発現できています。 やっぱり関係ないのですね。 >>APさん やはりコンフォメーションの問題ですかね。 一応N末、C末にHisTagが付くように設計したものも試したのですが 状況は改善しません。 変性条件では、結合されるような結果は得られていますが、 可溶性画分である程度取れてきているので、可溶性画分の リコンビナントを回収したいと考えております。

(無題) 削除/引用 No.7999-3 - 2019/06/19 (水) 10:57:47 - AP 分子量が大きいことそのものによるというより、大きなタンパク質なのでタグが内側に隠されるということが起きやすいんじゃないかと思います。 尿素あるいはグアニジン存在下の変性条件でアフィニティー精製してみてはいかかでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7999-2 - 2019/06/19 (水) 10:51:55 - おお Disagree 発現量は大きいほど不利になる。どのように発現を見てますか？CBBなどで明らかにバンドが見えてますか？

NiカラムやCoカラムに大きい分子量のタンパク質は結合しない？ 削除/引用 No.7999-1 - 2019/06/19 (水) 10:37:14 - あいみょん いつも拝見させていただき、勉強させていただいております。 分子量が約170kDaのリコンビナントタンパク質を大腸菌で発現させ 可溶性画分を回収した後、His・tagを用いたアフィニティー精製を 行ったところ、まったく結合しません。 分子量が大きくなると結合しにくくなる印象はありますが、 こんなものなのでしょうか？ 似たような経験が有る方が居たら、対処法や経験談などお伺いしたいです。 宜しくお願いします。

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