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ポリアクリルアミドゲルからのRNA精製 トピック削除
No.7985-TOPIC - 2019/06/14 (金) 19:56:38 - 高
初歩的な質問で申し訳ございません。

８％PAGEを行った後、ゲルを切り出して0.3M NaClで溶解させた後遠心をし、上清のみをろ過してエタ沈を行い、RNAを精製しました。

最後に得られたペレットを水に溶解しようとした際、ピペッティングがうまくいかず、ゲル粒子が見えたため、ゲルが混ざってしまったと考えられます。何とかしてRNAだけ再度取り出す方法はないでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.7985-11 - 2019/06/16 (日) 17:12:32 - おお
そうそう、RNA精製キット使えと書いちゃったけど、シリカ系でTotal RNA精製するようなキットも１００ｂとかきついですね。

(無題) 削除/引用
No.7985-10 - 2019/06/16 (日) 16:06:17 - AP
ターゲットのサイズが不明ですが、確かにLiCl pptではtRNAやsmall mRNAは除去されますから8% PAGで分離するようなサイズだと危険かも。
こちらでは300 nt以下では勧められていない。
https://www.neb.com/protocols/2013/04/02/purification-of-synthesized-rna-e2050

(無題) 削除/引用
No.7985-9 - 2019/06/16 (日) 13:31:56 - おお
LiClは短いRNAの分離には向いてないということを付け加えておきます。１００bぐらいではかなり効率が悪くなる。

(無題) 削除/引用
No.7985-8 - 2019/06/16 (日) 12:57:46 - AP
私も脱粒子用のフィルターかければいいのにと思ったけれど、すでに一度通しているとあったので、

ポリアクリルアミドを除く目的ではやったことはないけど、他の知識lの援用で、
1. 終濃度2.5 M LiClでRNAを選択的に沈殿する(10 M LiClを1/3 vol加えて遠心)。材料からRNAを精製したりRNAから多糖や遊離のヌクレオチドを除去するときに使われる手法。各種実験書にも載っている。

2. EtOHのみあるいはDMFのみを加えてポリアクリルアミドを沈殿。上清に塩を加えてRNAを沈殿させて回収。EtOHのみDMFのみでRNAを冷凍保存し、使用時に塩を加えて回収するのは保存法としてある(cf. Molecular Cloning)。ポリアクリルアミドはこれらの溶媒中で沈殿または相分離するとある。
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/app.20608

(無題) 削除/引用
No.7985-7 - 2019/06/15 (土) 12:27:15 - 高
皆さまありがとうございます。

フェノール抽出をしてみたのですが、ゲルまで水層にいってしまいました。
0.3MNaClで体積を増やしてもう一度フィルターにかける、というのはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.7985-5 - 2019/06/15 (土) 03:51:30 - おお
>フェノール抽出をすればゲルかすが取り除けそうに思います。

目に見えないような粒子がエタ沈で落ちてきたりするんですよねぇ。

別案 削除/引用
No.7985-4 - 2019/06/15 (土) 00:36:55 - ふみ
フェノール抽出をすればゲルかすが取り除けそうに思います。

フェノール抽出でのRNAのロスが気になる場合の手は下記の通り。
抽出済みの下層(フェノール層+中間層+取り残し水層)に取った量の水を加える。
ボルテックスミキサーにかけて、遠心して、上清を取る。
最初の上清と次の再抽出上清を合わせてアルコール沈殿。

一案として 削除/引用
No.7985-3 - 2019/06/15 (土) 00:29:38 - ふみ
1. 9割方の上清を取る。(ゲルかすらしきものを取らない。)
2. 取った量ぐらいのx1/10 TEを取り残し1割の方に加える。
3. 9割方の上清を取る。(ゲルかすらしきものを取らない。)
4. 取った量ぐらいのx1/10 TEを取り残し1割の方に加える。
5. 9割方の上清を取る。(ゲルかすらしきものを取らない。)
(6. 1,3,5の上清を集めてlinear polyacrylamideを共沈剤として加え混ぜる。)
7. 2-PrOH/NaOAcでRNAを析出させる。
8. 70% EtOHでリンスする。
9. 適当な量の適切な液体に溶かす。

PAGE精製なら共沈剤はおそらく要らない。でも加えてもよい。

(無題) 削除/引用
No.7985-2 - 2019/06/15 (土) 00:26:28 - おお
RNA抽出キットを使えばどうでしょうか。

ポリアクリルアミドゲルからのRNA精製 削除/引用
No.7985-1 - 2019/06/14 (金) 19:56:38 - 高
初歩的な質問で申し訳ございません。

８％PAGEを行った後、ゲルを切り出して0.3M NaClで溶解させた後遠心をし、上清のみをろ過してエタ沈を行い、RNAを精製しました。

最後に得られたペレットを水に溶解しようとした際、ピペッティングがうまくいかず、ゲル粒子が見えたため、ゲルが混ざってしまったと考えられます。何とかしてRNAだけ再度取り出す方法はないでしょうか？
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