BioTechnicalフォーラム [ベクターにインフレームでインサートを連結するためのプライマー]

ベクターにインフレームでインサートを連結するためのプライマー

No.798-TOPIC - 2012/07/31 (火) 08:03:17 - 初心者

ベクターにインフレームでインサートDNAを連結したいのですが、ベクターのコドンとインサートDNAの制限酵素切断部位が合いません。この場合、制限酵素切断部位と5'側の開始コドンATGの間に塩基を付加してプライマーを設計するのが一般的でしょうか？その場合、付加する塩基は、ATGCのどれを選択すればよいでしょうか？
具体的には、例えば以下のpEGFP-C1のMCSで、

TAC AAG TCC GGA CTC AGA TCT CGA GCT
　　　　　　　　　　　　　　　　　 XhoI
XhoI (CTCGAG) の制限酵素部位にインサートDNAを挿入したい場合、インフレームにするために、プライマーは CTCGAG**ATG... とするのが一般的でしょうか？その場合、**に入れる2つの塩基は、ATGCのどれが好ましいでしょうか?

また、3'側の終止コドンと制限酵素部位の間にも、インフレームにするために塩基を付加すべきでしょうか?
　

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No.798-6 - 2012/08/13 (月) 20:14:01 - 初心者

ご解答ありがとうございました。

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No.798-5 - 2012/07/31 (火) 21:32:30 - Harmonia

単にインフレームにするなら、ベクターを制限酵素処理後に平滑末端にして、
末端が平滑になる(つまりTAクローニング向きでない）PCR酵素で余計な配列
を入れないで設計するという手もあります。

ベクターの切り口を平滑末端にできるのであれば、どの制限酵素を使っても
可能なので、ベクター側のどこに入れるかを自由に決めることができます。
その反面、なぜその制限酵素サイトに入れなきゃいけないか、No.798-4 の
Qさんの問いかけとおなじ疑問を持ちつつ実施すべきですが。

また、No.798-3 の APさんが例示されているSal1 vs Xho1, BamH1 vs Bgl2
だと、結合後は元の酵素で切れなくなるので、切れないことを利用して、
つながったフラグメントを次のステップで切り出すために余計な酵素サイトを
つぶすとか、その先の計画しだいでどういう設計にするかの優先度は変わり
ます。

質問者さんの問い、ぼくだったら、GAにしてスペーサー代わりにGlyにします。

(無題)

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No.798-4 - 2012/07/31 (火) 14:12:59 - Q

フレームがあえば、どれでもいい。
これだったらなったという結果論はあるが、最初から正解なんてない。

＞この場合、制限酵素切断部位と5'側の開始コドンATGの間に塩基を付加してプライマーを設計するのが一般的でしょうか？

なぜ開始コドンを入れなければいけない、と思ったのかが疑問。
説明してみて下さい。

老婆心ながら、質問して「正解or解答」を得るよりも、
なぜ質問者がそういう考えを持ったのか？それはどうして違うのか？正しいのか？
これをきちんと理解することが重要なのでは？

＞また、3'側の終止コドンと制限酵素部位の間にも、インフレームにするために塩基を付加すべきでしょうか?

これも然り。なぜ質問者はそう思ったのか？
それは一体どういうことになるのか？
それを理解するのか重要なのではないでしょうか？

(無題)

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No.798-3 - 2012/07/31 (火) 13:05:10 - AP

後ろにタンパク質を融合する場合はATG (Met)から始める必要はありません。逆に、下手に開始コドンを入れるとたまたまそちらからの翻訳が起こってしまうかもしれません。私なら開始コドンのATGを外して二番目のコドンからか、それに数残基の適当なスペーサを付加して、インフレームで繋ぎます。

フレーム合わせのために、プライマーをデザインしてPCRをするというのも今風であたりまえの方法ですが、昔ながらの手段を挙げておくと、

・3'陥没制限酵素消化末端をKlenowなどでfill-inしてbluntingののち、blunt-end ligationする。4塩基の陥没末端なら+1のフレームにずれる。

・制限酵素消化の突出末端をT4 DNA pol (3'突出の場合）あるいはMung been nuclease (5'突出の場合）などで削ってblunt-end ligationする。4塩基突出なら-1 (+2)のフレームにずれる。

・compatible end ligationを利用する。インサートの末端と同じ酵素で消化したクローニングサイトに入れるとフレームがずれてしまう場合でも、compatible endを生じる別のサイトでいれるとフレームが合うかもしれない。
例えば、Sal1 vs Xho1, BamH1 vs Bgl2

・partial fill-inを利用する。例えばXba1末端をCとTだけ入れて、Hind3末端にAとGだけ入れて、klenowでfill-inすると、それぞれ5'CTと5'AGの相補となる2塩基突出末端となりligationできる。上手く利用出来る組合せがあればこれでフレームが合わせられるかもしれない。

(無題)

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No.798-2 - 2012/07/31 (火) 09:30:31 - ンンノ

具体的に塩基の種類で一般則はありませんが、挿入の結果出来るコドンが
ストップコドンだったりレアコドンにならないようにするのが普通です。
コドンがコードするアミノ酸がチャージが強かったりかさ高かったりする
のも避けます。

ところで融合蛋白の載った発現ベクターなら、普通はフレームが３種類
用意されてると思います。

ベクターにインフレームでインサートを連結するためのプライマー

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No.798-1 - 2012/07/31 (火) 08:03:17 - 初心者

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