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(無題) 削除/引用 No.7967-6 - 2019/06/12 (水) 21:50:47 - なー くわがた様のようなやり方も聞いたことがあります。 先輩からはしなくてもいけると言われていたので、あまり調べてはいませんでしたが、この際に習得できれば今後十分に価値はあるように思いました。 初めてのことで踏ん切りがつかなかったのですが、やってみようと思います！

ひと工夫 削除/引用 No.7967-5 - 2019/06/10 (月) 22:14:48 - くわがた よくmicroRNA発現ベクターを作製しますが、sense鎖（passenger鎖）の中ほどの配列をいじってstemの途中にbulgeが入るようにデザインしています。 dsRNAの発現はインターフェロン応答の活性化により非特異的な翻訳抑制等を引き起こす可能性がありますが、bulgeの導入によりこの影響を少なくすることが出来ると読んだことがあり、以来このデザインで実験を行っています。 （Bauer et al.,Gene Therapy volume 16, pages 142–147 (2009) 通常は上記の論文のFig. 3aのmiB3のように、hs miR-30のstemに倣ってsense鎖の3’側より8-9番目辺りに「TC」を挿入するデザインを採用しています。 こうすることにより、stemが程よくtightでなくなるのか、配列確認でのトラブルは経験しなくなりました。 あと、antisense鎖（guide鎖）との配列の違いも大きくなり、RISCにguide鎖が選択的に取り込まれ、off-targetの低減にも寄与しているのではないかと期待しています（こちらはエビデンスはなく、妄想に過ぎないかも知れませんが）。 とにかくこうして発現させたmiRNAは、少なくとも標的に対してはしっかり効いています。 ご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.7967-4 - 2019/06/10 (月) 19:47:14 - なー 以前に作成したものは読めていたので、今回も同様のやり方で作成していたのですが…同じくシーケンス条件を変えてもうまくいきませんでした。 インサートは合成です。（ForwardとBackをmixしてアニーリングしてます。） おそらく理研から買ったものだと思うのですが…研究室内で使いまわししている状態のpENTR4-tetです。 そうですね、一度最後までやってみてKDできているかやってみようかと思います。それでうまくいっていればラッキーだったと思いたいです。

(無題) 削除/引用 No.7967-3 - 2019/06/10 (月) 18:51:22 - TS shRNAはヘアピン構造のせいでシーケンスがかなり読みにくいと思うのですが、どうしょうか。 わたしは以前にGenescriptのベクターを使ったことがありますが、どうしてもヘアピン構造の前でリードが止まってしまいました。 いろいろとシーケンスの条件を試しましたが、うまくいきませんでした。 どこのshRAN vectorをお使いかわかりませんが、そのメーカーからTipsかなにか出ていませんかね。 それとインサート配列は合成品ですよね。 制限酵素処理やPCRで入っていることが確認できれば、OKにしてはいけませんか。 理論上はほぼほぼ大丈夫と思いますが。 私は結局これでOKにして、KDも確認できたので、そのまま進めました。

(無題) 削除/引用 No.7967-2 - 2019/06/10 (月) 16:00:55 - おお すべてのクローンで同じ結果ですか？

shRNA作製で配列が切れる 削除/引用 No.7967-1 - 2019/06/10 (月) 15:23:42 - なー shRNAを作製において、siDirectでプライマーを設計し、エントリーベクターを制限酵素でcut後にLigation high ver.2でLigationし、DH5αにtransformしています。 その後Midi-prep産物をシークエンスで読む際に目的配列がところどころで切断、または読めていない部分が生じています。 このような現象になったことがないため、どこに問題があるか分からないのですが、このような経験をお持ちの方はどのように解決されたのでしょうか？

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