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制限酵素処理後に大きなバンドが現れた トピック削除
No.7962-TOPIC - 2019/06/07 (金) 11:40:02 - む
PCR産物推定101bpの確からしさを調べるために、PCRの終わった反応液20マイクロリットルをEt-ptしてバッファを除き、H2Oで再溶解して一部を取り分けて制限酵素BstEIIで処理し、残りの未切断断片と並べて15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離しました。

未切断断片は101bpのシングルバンドでした。
BstEII37度30分処理した試料は101bpバンドが消失し、代わりにおよそ85bpの予期した切断断片が現れ、そのほかにおよそ120bpや140、160bpなどの元のサイズより大きなバンドが現れました。

元の長さより大きな断片はどのようにできたのでしょうか？
どうぞよろしくご教示ください。
　
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(無題) 削除/引用
No.7962-5 - 2019/06/07 (金) 17:14:56 - む
No.7962-4 APさん、ありがとうございます。

>lambda Hind III断片などは両末端のcos site（12 ntほどの付着末端）がアニールしてに断片が一本の大きなサイズのバンドを与える

4.4kbバンドが23kbにくっつくのでしたっけ。

>DNAに対してアフィニティーが高い制限酵素だとDNAにしがみついたままで泳動に干渉することがあります（それを防ぐのにSDSは有効）。

TaKaRa の6xローディングダイを使用しました。SDS が入っていなかったと思います。

BstEII の至適温度についてまさにその通りで、しかし今回使用したのはNEBのハイフィデリティータイプR3162で、37度が指定されていました。

次回泳動前に55度加温かSDS添加を試そうと思います。

(無題) 削除/引用
No.7962-4 - 2019/06/07 (金) 16:48:19 - AP
>制限酵素などがDNAに結合したままというのは、SDS などを少し加えて泳動すると変わるでしょうか。試料が残っているので次の機会に載せてみたいと思います。

泳動直前に55-60℃で5分ほど加熱すればいい。
最近の人は馴染みがないかもしれないけど、サイズマーカーとしてよく使われていたlambda Hind III断片などは両末端のcos site（12 ntほどの付着末端）がアニールしてに断片が一本の大きなサイズのバンドを与えるので、泳動前にそういった処理をしていた。


異説ですが、サイズが大きいのは酵素DNA複合体だったりしませんか？
ローディングダイに十分量のSDSは入っているでしょうか？

というのは、ちょっと確認してみたらBstEIIの至適温度は60℃、37℃では50%に下がるとあります。認識サイトに結合したものの切断が起こらないでそのままとどまっている酵素があったりして。

そうでなくても、DNAに対してアフィニティーが高い制限酵素だとDNAにしがみついたままで泳動に干渉することがあります（それを防ぐのにSDSは有効）。

(無題) 削除/引用
No.7962-3 - 2019/06/07 (金) 13:13:15 - む
No.7962-2 おおさん、ありがとうございます。
BstEII 切断で生じた末端GTNACが凝集にきいてしまっているということですね。

制限酵素などがDNAに結合したままというのは、SDS などを少し加えて泳動すると変わるでしょうか。試料が残っているので次の機会に載せてみたいと思います。

解釈可能で、ありそうなことらしいと分かって安心しました。

(無題) 削除/引用
No.7962-2 - 2019/06/07 (金) 12:31:07 - おお
コへっシブな末端配列同士がアニーリングしてしまっている。
制限酵素などがDNAに結合したまま泳動されて泳動パターンがシフトしてしまった可能性。

制限酵素処理後に大きなバンドが現れた 削除/引用
No.7962-1 - 2019/06/07 (金) 11:40:02 - む
PCR産物推定101bpの確からしさを調べるために、PCRの終わった反応液20マイクロリットルをEt-ptしてバッファを除き、H2Oで再溶解して一部を取り分けて制限酵素BstEIIで処理し、残りの未切断断片と並べて15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離しました。

未切断断片は101bpのシングルバンドでした。
BstEII37度30分処理した試料は101bpバンドが消失し、代わりにおよそ85bpの予期した切断断片が現れ、そのほかにおよそ120bpや140、160bpなどの元のサイズより大きなバンドが現れました。

元の長さより大きな断片はどのようにできたのでしょうか？
どうぞよろしくご教示ください。
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