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(無題) 削除/引用 No.7961-4 - 2019/06/09 (日) 15:52:42 - おお 個人的には分光光度計の測定方法に問題がありそうな気もしてますが、、、具体的にどのような計り方をしているのか、、、 昔ミリQ水取立てをすぐ実験に使おうとするとあわぶくぶくでちょっと困ったという自体もあったので、もしかしたら溶存する気体の濃度が高く酸素などが還元を邪魔しているような感じなのかもしれません。フィルターカップでフィルターすると確かに陰圧になるのでそういう場合は解決するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7961-3 - 2019/06/08 (土) 19:13:27 - toto 0.5mM DTTですね。10倍のDTTを加えたときには、CytCの比が10になることを確認されたのであれば、あとは、cDNAさんのいわれるように水しかないように思えます。酸化還元電位でしょう。窒素でブクブクするか、脱気するとかかな。

(無題) 削除/引用 No.7961-2 - 2019/06/08 (土) 18:42:06 - cDNA 試薬を変えて確認しているということは他の部分の問題ではないでしょうか。容器か水。ちなみに私はこのようなケースではまず水を疑います。milliQ使っている時点で、普通は疑わないからそこが問題の時に解決が遅くなるんですよね。 汲みたてのmilliQでしょうか。管理の悪いmilliQより蒸留水の方がましな場合もあります。 物質の混入ならいい処理が思いつきませんが、微生物なら0.22のフィルターで解決するでしょう。また、還元状態の測定時に565nmで時間変化を見てはどうでしょうか。

チトクロームCが還元できない 削除/引用 No.7961-1 - 2019/06/07 (金) 10:42:28 - 研究医 お世話になります。 ミトコンドリアのcomplex IVの活性測定を準備しています。 cyt cをまず還元しておいて、それが酸化されていく経過を分光光度計で追って酵素活性を求める、というのがアッセイの概要です。 手順を以下にお示しします。 cyt C粉末をmilliQに溶解して0.22mM cyt C溶液を1ml作成、 1M DTTをmilliQで10倍希釈し作成した0.1M DTT 5ulを加え、転倒混和し室温で15分待つ。 キット付属のアッセイバッファーで20倍希釈しA550/A565比を測定。比が10以上であることを確認後、本アッセイに移る。 という様にやっても比が5-6程度で10まで到達しません。色調も茶褐色がやや明るくなる程度で、還元が不十分な色調です。 キット付属の1M DTTの酸化を疑い、ラボの粉末から調整しなおしたり、別途購入したりしましたが上手くいきません。 cyt Cについても、別途購入したものを使用しましたが上手くいきませんでした。 分光光度計はプラスマイナス0.7nmの波長で測定できるので550と565は区別できていると思います。 ここまでくると自分の手技を疑うしかないと思うのですが、 DTTでcyt Cを還元したご経験がある方、手技などアドバイスを頂けると幸いです。(もっとincubation時間を伸ばす、反応温度、vortexで強めに混ぜるなど) メーカーに質問したところ、このlotはワークしている、反応温度や遮光は関係ない、時間は15-20分で十分との返答でした。

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