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PCRのプライマー設計について トピック削除
No.7957-TOPIC - 2019/06/06 (木) 10:31:43 - み
4月から研究室に配属になった大学生です。
現在、基礎トレーニングでPCRクローニングをしています。
先日、クローニングした遺伝子をシーケンスで読んだところ、全く違う遺伝子が入っていました。
プライマーの設計の問題かと思い、色々と調べていたところ、「プライマーの3'末端がTだとミスプライミングが起こりやすい」というような記事を見つけました。
ただ、どうしてそのようなことが起こるのかがわかりません。
どなたか知っている方がいらっしゃったらご教授くださいませんでしょうか。
また、プライマー設計の際に気をつけていることなどあれば合わせてお教えいただけますと幸いです。
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.7957-4 - 2019/06/07 (金) 01:37:17 - おお
>「プライマーの3'末端がTだとミスプライミングが起こりやすい」というような記事を見つけました

ちょっと違和感がある記述ですが、正確にそのように書いてましたか？
それはともかく最後にTやAがきてもPCRがかからないわけではないし、実験上の制約があるときはそういうプライマーを使うこともあります。
一つの可能性と考えていろいろほかの要素もあぶり出してみるほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用
No.7957-3 - 2019/06/06 (木) 13:38:01 - あいみょん
もっと精製からシークエンスまでの細かい流れがわからないと問題点も指摘できないけど、末端がTなだけで配列が全く違うもの（全くの意味合いも気になるけど）をクローンとして取ってくることなんてありえないと思う。

よく異なる遺伝子を取ってきたという言わばはずれを引くのはよくあることなので、何回も同様な操作を経て、たくさんクローンを取ればいいと思います。

PCRプライマー設計のコツは、おっしゃる通りに末端Tは避けるとかはもちろんの他
・プライマーを長い配列にする（25~30 base）
・GC含量を50％くらいにする
・プライマー同士で相補的な配列は作らない

とかありますが、そんなの気にしなくても増えるときは増えるし、
気にしても増えないときは増えないものなので、試行錯誤してみると
いいかもしれません。こういうテクは、みんな自己流みたいなのを持っていて、良く揉めるので（気にする点、気にしない点の話）

(無題) 削除/引用
No.7957-2 - 2019/06/06 (木) 12:12:06 - moz
「プライマーの3'末端がTだとミスプライミングが起こりやすい」に関して、
Taqの性質か、GCに比べてアニールが弱いからかな？と思いますが、全く別の遺伝子が増幅されたのは別の理由だと思います。
お使いの酵素が不明ですが、3'-5' exonuclease活性を有するいわゆるHigh Fidelity（高正確性）酵素などは、Primerの3'の1-2base位のミスマッチは削って複製可能です（増幅効率は落ちます）。
PCRのシミレーションを行うフリーソフトやWebもありますので、プライマーの妥当性を検討してみたらいかがでしょうか。

勉強するなら成書も沢山ありますが、PCR Primer 設計　でググると、例えば
www.takara-bio.co.jp/kensa/pdfs/book_1.pdf
www.sigmaaldrich.com/japan/lifescience/roche/genomics/pcr/application-hints.html
www.learningatthebench.com/10-tips-for-pcr-success.html
www.learningatthebench.com/pcr-basic3.html
現在はオリゴDNAの価格も安くなっているので、cDNAやゲノムDNAを鋳型とするクローニングの場合、20mer程度の短めのプライマーで特異的増幅をするPCR条件探しで四苦八苦する（時間を無駄にする）より25base以上の特異性の高いプライマーを設計した方がアニール温度を高めでPCRしたり、DMSO・ベタイン・トロンビン・deaza-dGTP等を添加する手法も使いやすく、確実性が高いのでお勧めです。

PCRのプライマー設計について 削除/引用
No.7957-1 - 2019/06/06 (木) 10:31:43 - み
4月から研究室に配属になった大学生です。
現在、基礎トレーニングでPCRクローニングをしています。
先日、クローニングした遺伝子をシーケンスで読んだところ、全く違う遺伝子が入っていました。
プライマーの設計の問題かと思い、色々と調べていたところ、「プライマーの3'末端がTだとミスプライミングが起こりやすい」というような記事を見つけました。
ただ、どうしてそのようなことが起こるのかがわかりません。
どなたか知っている方がいらっしゃったらご教授くださいませんでしょうか。
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