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(無題) 削除/引用 No.7945-14 - 2019/06/05 (水) 15:29:28 - mom >[Re:13] おおさんは書きました : > そうすると本質的にLigation Independent Cloning (LIC)と一緒なんでしょうかね。そうするとなんか５’の突出はじゃまになりそう。。。 Invtrogen社のTOPO directional cloningみたいに、多少の突出は大腸菌がなんとかしてくれると期待して。。。

(無題) 削除/引用 No.7945-13 - 2019/06/05 (水) 09:25:54 - おお >inFusionはワクシニアウィルス由来のDNAポリメラーゼの3'->5' exonuclease活性 そうすると本質的にLigation Independent Cloning (LIC)と一緒なんでしょうかね。そうするとなんか５’の突出はじゃまになりそう。。。

(無題) 削除/引用 No.7945-12 - 2019/06/04 (火) 00:14:35 - とも 貴重なご意見ありがとうございます。 インサートとベクターが相補的な関係なのを考えると、5'>3'と3'>5'の両方の活性がないとexnoclease活性にしても、またrecombinationにしても余分な配列が残る可能性があると思っていますが、興味本位で試してみようかと思っています。 バックアップでやはりプライマーを注文して、マニュアル通りのやり方を優先することにします。 ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.7945-11 - 2019/06/03 (月) 18:28:54 - mom 特許文書によると、inFusionはワクシニアウィルス由来のDNAポリメラーゼの3'->5' exonuclease活性を利用しているようです。 Fill-inやligation活性のある酵素は使用していないようで、1本鎖部分がアニールしたのち導入された大腸菌内で修復されるようです。 これらを考えると効率・精度は低下すると思いますが、現状でも目的クローンが取れる可能性があります。精度は不明ですのでシークエンス確認は必須だと思います。 メーカーに聞いてみれば良いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7945-8 - 2019/06/03 (月) 13:36:16 - おお ホモロｶﾞｽリコンビネーションということなので、ベクター側と相同性のある部分からインサートの配列を参照して伸長することになるはず。だから原理的には制限酵素認識配列のキレ残りの部分は入らない。 ただしマニュアルにはそのような使い方を推奨してないからそういった場合は想定してないか、効率が落ちたり配列が乱れたりなど理由があるのかだと思う。 で、この酵素を含む溶液も何であるか公開されてない（多分大腸菌からの粗抽出物かもしれないがそれをキャラクタライズした論文を探すのもできない）みたいだから調べようもない。 まあやってみなきゃわからんよ。 ツールで配列を確認はいいけど、多分原理原則で作っちゃうだろうから、細かい酵素特性は考慮されてないように思いますがどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7945-7 - 2019/06/03 (月) 08:59:32 - そのままに 難しく考えず、ツールで配列を確認しましょう。 https://www.takara-bio.co.jp/infusion_primer/infusion_primer_form.php

(無題) 削除/引用 No.7945-6 - 2019/06/02 (日) 21:58:50 - マスター　オブ　マスター 一般的な手法だと、制限酵素の認識配列の一部＋ベクター側の配列を含んだプライマーでPCRを行い、n fusionクローニングをするのですが、とぴ主さんの目的だと異なるアプローチが必要ですね。 制限酵素の配列を含んではならないとなると、インバースPCRを行うのが良い思います。ベクターの20ntのところをプライマーにして、インバースPCRを行い、in fusionクローニングすればよいと思います。 ちなみに、制限酵素の配列を含んではならない理由が気になるのですが、差支えなかったら教えていただけませんか？

(無題) 削除/引用 No.7945-5 - 2019/06/02 (日) 21:43:29 - とも 返信が遅れてすいません。 わかりづらかったと思います。 ベクター側はPCRをしなくて制限酵素で切っていますので、共通の配列(20nt)に続いて余分な配列が残っています。 インサートはPCRをしていますので、共通の配列(20nt)以外にそのような制限酵素の残りの配列はないです。 ベクター側の配列が入ってはいけないというのは共通配列に続く制限酵素の残りの配列は完全に除外したいです。 ですので、共通配列の直後はPCR産物のようにしたいです。 (20 nt)GCGCGC----TTTTGA(20 nt) キットを購入しています。 exonucleaseが5'からまず削ることを考えると、制限酵素由来の配列は残りそうですが、経験者のご意見を聞きたかったです。 >[Re:2] マスター　オブ　マスターさんは書きました : > 質問に対して、質問で返してしまい申し訳ないのですが、ベクターにクローニングするのに、ベクター側の配列が入ってはいけないとはどういうことでしょうか？ > ベクターのHindIIIとxhoIの制限酵素の認識配列の部分を組み込まないでクローニングしたいということでしょうか？ > また、()内の20ntというのは、infusion用の配列ということでしょうか？ >

(無題) 削除/引用 No.7945-4 - 2019/06/02 (日) 15:53:56 - ん 横道にそれて申し訳ありません。 同じ方法で in fusionを何度も行っている者ですが、ツールを使わず自分で設計しているのでしょうか？ タカラバイオのツールを使ったほうが確実だと思います。 vector側の配列が入ってはダメの意味が分からず、質問に答えられず申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.7945-3 - 2019/06/01 (土) 08:23:28 - mom InFusion TAKARAでググれば、Manualもダウンロード出来るし、webもhit しますよ。 catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006645

(無題) 削除/引用 No.7945-2 - 2019/06/01 (土) 03:47:38 - マスター　オブ　マスター 質問に対して、質問で返してしまい申し訳ないのですが、ベクターにクローニングするのに、ベクター側の配列が入ってはいけないとはどういうことでしょうか？ ベクターのHindIIIとxhoIの制限酵素の認識配列の部分を組み込まないでクローニングしたいということでしょうか？ また、()内の20ntというのは、infusion用の配列ということでしょうか？

in-fusionと制限酵素サイト 削除/引用 No.7945-1 - 2019/06/01 (土) 01:37:35 - とも おそらくどこかに記載されていると思うのですが、質問させてください。 いまin-fusionをつかってのクローニングを行っていますが、ベクター側はPCRではなく制限酵素でカットしています。 例えば下のようです。 vector---(20 nt)AAGCTT-----CTCGAG(20 nt)---- これをHindIIIとXhoIで切ります。 vector---(20 nt)A　　　　　　TCGAG(20 nt)---- vector---(20 nt)TTCGA　　　　　　C(20 nt)---- これにPCRで増やした(20 nt)GCGCGC----TTTTGA(20 nt)を入れたいのですが、vector側の配列が入ってはダメなクローニングです。 この場合、つなぎ目の配列はどのようになるか予測できるでしょうか？ 初歩的な質問ですがおねがいいたします。

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