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普通のDNAシークエンサーの配列ピークで突然ピークが低くなる トピック削除
No.7942-TOPIC - 2019/05/31 (金) 00:58:55 - MYST
プラスミドを受託で構築し、実験に用いていましたが期待通りの結果が出なかったためプラスミドを疑い、念の為DNAシークエンシングを行いました。


ベクターバックボーンはpUC57ですが、インサートは400bpほどのものです。
ベクター上のM13のフォワードとリバースプライマーを用いてシークエンスしたところ、バックボーンまではいつも通りの強いピークが認められますが（クロマトグラムというのでしょうかATGCのピークのことです。）、400bpのインサートのところに来ると突如そのピークが20分の1ほどの高さになっていました。
2度行い、そのどちらでもそうでした。

M13プライマーはMCSサイト近傍にあるので、シークエンシングの限界というわけではないです。
これは一体何を意味しているのでしょうか？

ただその小さいピークを拡大すると、確かに配列はあっていそうです。
初めての経験で驚いています。原因をご存知の方がいらっしゃれば教えていただけませんでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.7942-7 - 2019/06/01 (土) 04:02:32 - マスター　オブ　マスター
pUC57ということは、人工合成でしょうか？
期待した結果が得られなかったということですが、人工合成したものを直接用いて実験を行なっておりませんか？
人工合成の場合、変異の入ったものがかなりの割合で混じっていることがあります。一度、適当なコンピテントセルにトランスフォームし、シングルコロニーを広い、シークエンスで正しい配列と確認できたクローンを用いたほうが良いと思います。（今回の質問はシークエンスの内容に関してなので、やや的はずれな回答になってしまい、すみません）

(無題) 削除/引用
No.7942-6 - 2019/05/31 (金) 11:35:53 - AP
よく知られたトラブルでいろいろなところで記載されていると思いますが、
一例として、
https://www.eurofinsgenomics.jp/media/29305/seqトラブルシューティング2014oct.pdf


引用
"※多くの汎用べクターにはリンカーに隣接するパリンドローム配列があり、シーケンスすると急激なシグナルの低下が見られることがある。これはサンガー法の欠点ですが（略）。"

プラスミドクローンを読む時にいつでも起こることではないですが、選んだクローニングサイトによってインサートに隣接する制限酵素認識配列（パリンドローム配列）が多く残るようなコンストラクトだと起こりやすようなトラブルです。

サイクルシークエンスの条件をいじると改善するかもしれないけど（二次構造を解く工夫とか）、インサート内部にプライマーを設定して外向きに読むのが、簡単確実ではなかろうか。


結論としては、インサートの配列に問題があるから期待どおりの結果（どんな実験の？）が出なかったのではないんじゃないか？
でも、Seqの波形が異常だったように、その実験も隣接するパリンドロームが干渉している可能性はあるかも。

(無題) 削除/引用
No.7942-3 - 2019/05/31 (金) 01:46:08 - メラゾーマ
シークエンス反応を行う際のプラスミド濃度の問題の可能性があると思います。

高濃度だと最初の方はピークが強いのですが、すぐに弱くなります。
ベクター側に当たるプライマーなら、ちょうどインサート付近で弱くなりそうです。
それ以外に、配列上の問題を考えるのであれば、ベタイン等を用いるのもありだと思います。

(無題) 削除/引用
No.7942-2 - 2019/05/31 (金) 01:15:45 - おお
たしかAやG、AG、GAなどがいくらか並ぶとポリメラーゼが進みにくくなる場合があります。ただし必ずしもそうならないのでその前後の配列などの環境的なものがあるかもしれません。

普通のDNAシークエンサーの配列ピークで突然ピークが低くなる 削除/引用
No.7942-1 - 2019/05/31 (金) 00:58:55 - MYST
プラスミドを受託で構築し、実験に用いていましたが期待通りの結果が出なかったためプラスミドを疑い、念の為DNAシークエンシングを行いました。


ベクターバックボーンはpUC57ですが、インサートは400bpほどのものです。
ベクター上のM13のフォワードとリバースプライマーを用いてシークエンスしたところ、バックボーンまではいつも通りの強いピークが認められますが（クロマトグラムというのでしょうかATGCのピークのことです。）、400bpのインサートのところに来ると突如そのピークが20分の1ほどの高さになっていました。
2度行い、そのどちらでもそうでした。

M13プライマーはMCSサイト近傍にあるので、シークエンシングの限界というわけではないです。
これは一体何を意味しているのでしょうか？

ただその小さいピークを拡大すると、確かに配列はあっていそうです。
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