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(無題) 削除/引用 No.7940-13 - 2019/06/06 (木) 05:59:59 - rxcvbnm,./ IP実験では抗体のかわりに normal IgGを使って対照群を用意する必要がありますが、それはどんな感じでしょうか。 IgGのs-sは意外に切れにくくて、還元が不完全だとimmunoblottingで５０kや２５kだけでなく75k(1xH+1xL)あたりとか100K<(2xH+2xL)とかにも抗体由来のシグナル出たりすることがあります。糖鎖付加の関係で一定しませんがだいたいそのへんの分子量位置。 雰囲気的にその辺に原因ありそうにおもうのですが。 抗体／IgG由来の紛らわしいシグナルを回避するため、変性IgGとは反応しない2次抗体が市販されてたはずですので、使ってみたらどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7940-12 - 2019/06/05 (水) 08:43:59 - SS よく分かっていませんが、IPに使用した抗体が問題なら、VeriBlot for IP 免疫沈降法用二次抗体を使ってみては？

(無題) 削除/引用 No.7940-11 - 2019/05/31 (金) 15:43:39 - IPに迷うL おおさん みさん アドバイスありがとうございます。 ネガコンとか確かに考え不足でした。 ネガコンを入れてもう一回確認してみたいと思います。 また、BでIPすることも含めて検討してみたいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.7940-10 - 2019/05/31 (金) 12:05:17 - おお その１００kのバンドが特異的と全体的に見て言えそうならBのModificationとかIsoformとかParalogなどの可能性を考えてもいいかもよ

(無題) 削除/引用 No.7940-9 - 2019/05/31 (金) 11:56:15 - おお ところでその１００kぐらいのバンドはBが特異的に結合している主張に影響を与えますか？

(無題) 削除/引用 No.7940-8 - 2019/05/31 (金) 11:51:53 - おお BでIPしてAを検出するというデザインに変えてみたらどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7940-7 - 2019/05/31 (金) 11:14:57 - み はっきり言って説明が下手くそで状況がよく分からない。 ﾎﾟｼﾞｺﾝとネガコンを置きつつ、検出系も系統だてて行って、それぞれのバンドの特異性を確かめると良い。これは当たり前のことだな。

(無題) 削除/引用 No.7940-6 - 2019/05/31 (金) 09:50:49 - IPに迷うL みさん おおさん 返事ありがとうございます。 Bのmwがlight chainと近いから、実際Bやる時に、IgGのlight chainの影響を弱める二次抗体を使っていますので、light chainのところ真っ白です。Aは、普通のいつもの二次抗体でやっていましたので、light chainはちゃんと出てきました。 （一回BをAの二次抗体でやってみたら、light chainのところバンドが出てくるですが、やはりBはAのバンド付近に出てきました。） また、Intact IgGに関して、同じサンプルで流したら、AとBを別で抗体を反応させて、IgGのバンドも同じ濃さになると思いますが、Aのmwの辺りに、Bの濃さがAと違います。 ABのメンブレンは完全に別でやったので、コンタミはないと思います。 InputとOutputも普通の抗体でやりました。（今思ったけど、ここのOutputもIPした後のBの二次抗体を使う方がいいですか？） ネガコンについて、ABの一次抗体全部モノクローンなので、現在は使っていないですが、一回入れてみます。 抗体のインキュベート時間及びWash回数の調整したことありますが、やはり変わらなかったです。

(無題) 削除/引用 No.7940-5 - 2019/05/31 (金) 01:50:56 - おお >washや2nd-HRP反応を一緒の容器でやるとA抗体が膜からはがれてB membraneにいったりするかもよ。 そういう経験はあります。 ちょっともやもやしているのですが、まずLight Chainのバンドは検出されているのですよね。 ネガコンは何を使っているのでしょうか？そのネガコンでは１００kのバンドは見えますか。たとえばバッファーだけでIPして現れるようだったら実験系が持つノンスペだし。AでIPしてAでWBしたときのネガコンはどんな感じですか？ Lysateを直接Bの抗体でWBして少しOverexposureしてそこにバンドがでますか？（んこれはあまり関係ないか） たとえば相当のタンパク量のAがIPされたとして、抗体と弱い親和性があるなら抗体の量を減らして、抗体の反応をもしO/Nでやっているなら１時間程度にしてみるとか。さらにWashを一回追加するぐらいでも有効だったりする。

(無題) 削除/引用 No.7940-4 - 2019/05/30 (木) 19:25:42 - み AはinputでもIPサンプルでも同じ分子量に検出されていますか？ 100kDa以上のバンドって本当にAなの？ Intact IgGってことはないだろうね。 たとえ2-MEで処理していても一部はIntact IgGが見えたりするけど。 B抗体で反応後、wash, 2nd Ab-HRP反応など一連の過程はAのmembraneとは全く別の容器で行われていますか？ washや2nd-HRP反応を一緒の容器でやるとA抗体が膜からはがれてB membraneにいったりするかもよ。 ところでBはIP with Aのレーンでlight chainあたりにも正しく出ているの？

(無題) 削除/引用 No.7940-3 - 2019/05/30 (木) 18:22:50 - IPに迷うL qqさん 返事ありがとうございます。 InputとOutputを流す時に、両方ともlight chain辺りに出てきました。

(無題) 削除/引用 No.7940-2 - 2019/05/30 (木) 18:14:54 - qq 別のレーンにCo-IPする前のBや、IPした後の素通りを泳動してBでウェスタンすると、light-chain辺りに検出されましたか？

免疫沈降でバンドが変な位置に出てくるのはなぜ？ 削除/引用 No.7940-1 - 2019/05/30 (木) 17:25:07 - IPに迷うL すみません。質問させてください。 現在、免疫沈降をやっています。 蛋白質AをIPして、mwが違う蛋白質Bとの結合をみようと思っています。 しかし、AをIPして、WBで確認したら、BがAと同じバンド位置に出てきました。 2MEを使って、IgGとかも切断されて、50のところに濃いバンドが出てきたので、蛋白質の結合が切断されたと思います。 ちなみに、Aは100kDa以上で、Bはlight chainの近くです。 同じような経験をした方がいらっしゃいましたら、解決方法を教えてもらえませんか？

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