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(無題) 削除/引用 No.7938-12 - 2019/05/31 (金) 01:19:32 - おお ま、入ってなさそうですね。抗体の特異性はその後問題になるでしょうけど、その細胞を使っている限りネガなのだからポジコンがいりますね。別の課題として並行してやっていけばどうですか？

(無題) 削除/引用 No.7938-11 - 2019/05/30 (木) 19:32:18 - み 本当にノックインされているかの確認が先決でしょうが、 今ある抗体でも他の抗体でもいいけどIPで濃縮されるバンドなのか確認してみたら。 CSTのanti-HA Rabbit mAb同じものを使用しているけど質はかなり良い。 Saos2の内在蛋白でクロスリアクトするものがあるのかは知らんけど。

(無題) 削除/引用 No.7938-10 - 2019/05/30 (木) 14:40:17 - HA mon様のおっしゃる通りです。 HA抗体でのウエスタンの前にgenomic PCRは行なっています。 ですが、残念ながらノックインのバンド（300 bpほど長い）ものは出ず、WTのバンドしか出ませんでした。 ひょっとしたらノックインされるとPCRがかかりにくくなる、、、という可能性も0ではないので、じゃあ3x HAでうんと感度が上がっているはずだから、もうwesternを行なってしまおう、と考えて今回行いました。 mon様のご意見には100% 同意しています。

(無題) 削除/引用 No.7938-9 - 2019/05/30 (木) 14:39:30 - Tracker シークエンスを読んでるかどうかというところを聞いたのは、momさんが仰っているようなことをされているか、まずそこが気になったからです。 何の薬剤でセレクションをかけたのかは分からないですが、薬剤耐性を持っていてもハズレ、なんてことは普通にあります。G418なんかは特にそういうケースが多かったです。 どういう方法で、とありますが、極めて普通の手順です。 ノックインならゲノムDNAを増やすプライマーの設計次第で、productの大きさで判別がつくので、それでクローンのスクリーニングをやります。 逆にゲノム配列としてノックインが確認されていないのにウェスタンで検出できるはずがないので。 WBとか抗体とか気にされるのはその後の話だと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.7938-8 - 2019/05/30 (木) 14:20:28 - mom >[Re:5] おおさんは書きました : > cDNAは配列を読まずともPCRで長さを見たりとかで検討がつくかもですよ。 ゲノムDNAを鋳型にしたPCR、これを行わない理由が分からない。 上記PCR以外にも、挿入部位内のプライマーとノックインに使用していない領域のゲノム上のプライマーとのペアもクローンの絞り込みに有用だし。 薬剤耐性だけでは確定的でないので、シークエンスやウェスタンブロット法での確認前というか、むしろノックイン実験に入る前にPCR primerを検討するのが普通だと思うよ。。 ノックアウト（イン）マウス作製実験の清書を読むと良いかも。

(無題) 削除/引用 No.7938-7 - 2019/05/30 (木) 13:04:20 - HA おお様、培養細胞A様、 ありがとうございます。 ほんとに安心（？）しました。 たぶん、ノックインは出来てはいないとは思いますが、まず抗体を手に入れ、それでもノンスペが出るなら免疫沈降、特異的なオルガネラのフラクショネーションを試してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7938-6 - 2019/05/30 (木) 11:51:49 - 培養細胞A おおさんも仰っていますが、whole lysateではノンスペが被っていても、局在するオルガネラを単離してウェスタンをするとキレイに見えることが経験としてあります。 目的タンパク質の濃縮とノンスペの減少の二点から、もしウェスタンでwhole lysateを用いているなら分画してみるのも良いかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.7938-5 - 2019/05/30 (木) 09:31:54 - おお cDNAは配列を読まずともPCRで長さを見たりとかで検討がつくかもですよ。

(無題) 削除/引用 No.7938-4 - 2019/05/30 (木) 09:15:53 - HA Tracker様、 ありがとうございます。 おそらくノックインはされていないと思います。 親と遜色なくHA抗体で染まるバンドが130kDに出ていましたので... もし、ノックイン細胞でのみ130kDのバンドが出れば、もちろんゲノムシークエンスをするつもりでした。が、そこまでいかずという段階です...。 Tracker様はノックイン実験はやられたことありますでしょうか？ もしあるのであれば、どのような方法を取られていますか？教えていただけると幸いです。 おお様、 ありがとうございます。 使用したのはCSTの抗体でした。クローンはC29F4で、Rabbit mAbです。 cellsignal.com/products/primary-antibodies/ha-tag-c29f4-rabbit-mab/3724 確かに二次抗体でのみでも出現するかは見ていません。 おお様のはマウスmAbとのことなので、一度これで試してみます。 細胞はSaos2細胞でした。 抗体を変えるという選択肢が考えられないほど落ち込んでいたので（ノックインが取れなかったことにではなく、ドナーテンプレートの作り直しから、ということに目の前が真っ暗になりました）少し動揺を抑えることができました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7938-3 - 2019/05/30 (木) 08:35:06 - おお BioLegendのAnti-HA.11 （Clone １６B１２）のモノクロを使ってますが、ヒトで過剰発現させる系ではほとんどバックグランドは気になりません。同じくローンでしょうか？ 2次抗体が直接反応したりしていることはとりあえず否定できるか見といたほうが良さそうですけど。 感度を上げるには発現している場所におおじてLysateの作り方を工夫するとか、とにかく今回確認したいというのならIP-WBとか手がないことはないです。

(無題) 削除/引用 No.7938-2 - 2019/05/30 (木) 08:30:28 - Tracker ゲノムやcDNAのシークエンスは読んで、ちゃんとノックインされていることは確認されていますか？

内在性の抗HA抗体反応性タンパク質 削除/引用 No.7938-1 - 2019/05/30 (木) 07:52:06 - HA いつも勉強させてもらっています。 ある遺伝子のお尻に3ｘHAタグを付加したノックイン細胞を作っていますが、薬剤選択してノックインされた細胞をひと月かけて増やし、昨日抗HA抗体でウエスタンをしました。予想では130kDaにバンドが出るはずです。 すると、親株であるノックインする前の細胞でも、ノックインした後の細胞でも130kDaに強いバンドが出ていました...。非常に動揺しています...。 数秒のX線フィルムへの焼き付けでしっかりバンドが出ていました。 ノックイン細胞のサンプルが、親株のウェルに混入した可能性は1レーンを間に入れているので極めて低いです。 どうにかノックインできただろうというものを時間をかけて増やして...仮にこれがノックインされた細胞ではないにしろ、ノンスペが130kDに来ているので、ドナーのコンストラクトからやり直してタグを変える必要があるのか...ということを意味しており非常に困惑しています。 抗HA抗体は特異的では無いのでしょうか？CST社製のものです...。 感度をあげるため3xHAタグにしました。内在性のタンパク質の局在や発現を見るためノックインの実験を行なっています。内在性のタンパク質に対する抗体は、内在性に発現する量が極めて低いためウエスタン、細胞蛍光染色ともにワークはしません。ノックインのみが唯一障害を回避する手段でした。 3xHAは感度が高くなるだろうと想定して付加しました。 他のタグの方がいいのでしょうか...？

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