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(無題) 削除/引用 No.7928-16 - 2019/05/31 (金) 11:14:59 - 薫 >momさん お返事ありがとうございます。 ビオチン処理無のネガコンではなくHAM処理無のネガコンにしていました。 確かにそれぞれの処理段階で処理ができているのかをそれぞれ確認することが一番の近道ですね。 NEMも含む試薬は用事調製しています。 もう一度先輩に質問してみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.7928-15 - 2019/05/30 (木) 03:21:24 - おお >IPとHAM処理が甘いかと思い質問させていただきました。 IPが甘いってよくわからないよ。IPで発現している割といっているから多分IPしてFLAGのWBをするとしっかり検出できるのかと思うけど、、まあそれでも定量的ではないけど。 NEM処理してないと理論上全部のCysがPalmitoylation化されるだろうからそれはそれでBiotin-BMCC化の指標になると思う。 COS-1にあなたの興味ある蛋白を発現させたとしてどの程度Palmitoylationされているかわかっているのかどうかも考慮に入れないといけないとおもう。 直接的であれ間接的であれ実験系がうまく行っているかどうか見極めれるデザインも必要である場合が多い。例えばTritonX114で膜結合蛋白を取ってくるとそこにあなたの蛋白はありますか？膜結合蛋白全体でPalmitoylationしている蛋白はどの程度検出できますか（そこに相当濃縮されていると思えますので）。 またIPで複合体の可能性を除くにはSDS１％でLysateを作りボイルして変性した状態でTritonX-100 1%とDeoxycholate０．１％を含むバッファーで１０倍にしてからIPというても取れます。 FLAGのお使いの抗体はお使いのバッファーでワークしてますよね。デタージェントとの相性もありますので。

(無題) 削除/引用 No.7928-14 - 2019/05/29 (水) 17:53:20 - mom 博士課程後期の先輩なら初めての実験でも、失敗原因の切り分け法（原因探求法）はアドバイスしてもらえると思います。 なぜなら、博士課程後期なら新しい実験に取り組んでいる（材料が違えば同じ手法でも新しい実験になる）ので、その組み立て戦略（どちらかというと戦術）のトレーニングの一環で学んでいるハズだけど。。 （カワイイヤツと思って気にかけてくれるかウザいと思われるかで、先輩の実力が分かるかも。。。）

(無題) 削除/引用 No.7928-13 - 2019/05/29 (水) 17:12:26 - mom 念のため質問しますが、NEMは使用直前に溶かせと記載されていますが守っていますよね（NEMが水溶液中で不安定なのでしょう。） IP+NEM処理の効率をみるために思いつくのは、 (1)NEMを加えないRIPAで溶解＞IP後、抽出原液・IPの残液（FT)・IP溶出液（and/or ビーズをSDS処理）を抗FLAG抗体とストレプトアビジンで検出。 この一連の操作はIP法で必ず一回は（予備実験等で）行うハズ。 (2)NEMを加えたRIPAで溶解＞上記と同様　 NEM処理の効率は、NEM処理により分子量（泳動度）が変わると判別しやすいけど。

(無題) 削除/引用 No.7928-12 - 2019/05/29 (水) 16:55:38 - mom IP-ABE法の経験は有りませんが、一般論的に、 Biotin-BMCC処理なしでは、どうなりますか（ネガコンの一つ）。 化学的処理ステップが2種あるので、どのステップ（IP：NEM処理：ABE処理）が成功していないか調べていくしかないと思う。 RIPAも複数の処方があるし（大きな違いはSDS含有か非含有か） ビオチン化タンパクも細胞内にあるので、Co-IP　(or 非特異的吸着）されているかもしれない。 ABE処理のポジコンが有ると良いけど。

(無題) 削除/引用 No.7928-10 - 2019/05/29 (水) 16:16:53 - おお ＞目的のタンパク質と相互作用しているタンパク質の中にパルミトイル化されるものはありませんでした。 タンパク質の中にパルミトイル化されると報告があるものはありませんでした。 といえない？ 分子量から当たってそれらしいものを細かく見ていくとどうよ。

(無題) 削除/引用 No.7928-9 - 2019/05/29 (水) 12:31:57 - S この方はわざとこういう書き方をされてるのでしょうか？ 略称で書くのは構いませんが、略称を用いる前にフルスペルを書くのは論文の中でも礼儀ですし、まずそこを断りを入れるべきです。’申し訳ないですが’の申し訳なさはどこから何に対してですか？ スペルするように指摘があるにも関わらず、再び新しい略称を書かれていますね。わざとですか？ >NEM >HAM >BMCC おそらくラボでもコミュニケーションを取りづらい方なんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.7928-8 - 2019/05/29 (水) 12:10:32 - 薫 ありがとうございます。おおさんの解釈であっています。 その発想は出てきませんでした。 Uniprotで検索してみましたが、目的のタンパク質と相互作用しているタンパク質の中にパルミトイル化されるものはありませんでした。Uniprotにあがってきていない情報もあるかもしれませんが、現状ではそうでした。 また、今回2サンプルIP-ABEを行いましたが、そのどちらともで非特異的なバンドが同じ位置に表れたので、ABEの処理がうまくできていないのかと思います。

(無題) 削除/引用 No.7928-7 - 2019/05/29 (水) 11:48:18 - おお 薄いって科学的ではないよね。 また書いていることがよくわからないですが、IPしたものをWBして、ストレプトアビジンでIPした蛋白以外のバンドが出るということ？まああっても不思議じゃないよね。IPした物自身じゃなくって、その複合体の他の蛋白がPalmitoylationされているという解釈。

(無題) 削除/引用 No.7928-6 - 2019/05/29 (水) 11:37:38 - 薫 ご指摘いただきありがとうございます。 確かに私の書き方が不適切でした。 遠さく推しさんには申し訳ないですが、ABE法はフルスペルでアシルビオチンエクスチェンジ法ととても長くなるので略称で書かせていただいています。 Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE) G. Stefano Brigidi1, Shernaz X Bamji1 上記の論文を参考に、IP-ABE法を行いました。 ハーベスト方法は当研究室で行われている方法で、COS-1細胞をPBSを用いて回収しRipa bufにNEMを加えたもので溶解し、磁性ビーズを用いてFlag-tagで3時間ほど落としました。 その後、洗浄しHAMを加え1時間置き、同様にBiotin-BMCCを処理し、SDS化させました。 WBでは、ストレプトアビジンとFlagでそれぞれ検出し、IPで発現している割にはABEでの目的のバンドが薄く、IPでは見られない非特異的なバンドも多く発現しています。 そこで、IPとHAM処理が甘いかと思い質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.7928-5 - 2019/05/29 (水) 08:29:04 - mom 「うまくいきません。」もできるだけ詳細に記載しないと、経験者でも返答しようが無いと思いますよ。 XXという論文通りに行ったのか？細胞が異なるのか？疑問は沢山有ります。 言い換えれば、「EtOH沈殿がうまくいきません」と同じ質問レベルなので、答える方は、おそらくDNAのことだとは思うけど、もしかしてRNA、タンパク？塩は入れたの？何塩？DNA量は？遠心力・時間は？沈殿は見えたの？？？？ あなたならどのようにお答えしますか？

(無題) 削除/引用 No.7928-4 - 2019/05/29 (水) 01:10:03 - 遠さく推し それでも書かれないとは。 そういう言わなくても分かるでしょうスタンスのトピックには返信はもらえないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7928-3 - 2019/05/29 (水) 00:11:46 - 薫 こんにちは。 確かにフルスペルを書いた方が親切でしたね。 詳しい方ならこの書き方でも理解してくれると思ったので、略称で書きました。

(無題) 削除/引用 No.7928-2 - 2019/05/28 (火) 20:49:00 - 遠さく推し IP-ABEやNEM等、フルスペルを書いた方が親切ではありませんか？

IP-ABE法について教えてください。 削除/引用 No.7928-1 - 2019/05/28 (火) 16:25:50 - 薫 IP-ABEを論文を参考にしていますがうまくいきません。 実験を始めたばかりで、先輩も同じような実験をしていないので聞くことができないので、教えていただきたいです。 特に、NEM処理を行うタイミングと免疫沈降について教えていただきたいです。 免疫沈降は磁性ビーズを用いています。 よろしくお願いします。

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